金 丹 金劍英 郭群依 高婭芬 林 紅 杜學(xué)峰 謝靜靜

1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院血液腫瘤內(nèi)科，浙江臺(tái)州 317000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院肝膽外科，浙江臺(tái)州 317000

肝癌患者每年的病死率較高，其主要原因?yàn)楦伟┢鸩‰[匿，確診時(shí)就已喪失最佳外科手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，因此手術(shù)治療效果不佳，發(fā)展分子靶向治療是目前的治療目標(biāo)。近年來(lái)，miRNA 已被證實(shí)是多種疾病的有效生物標(biāo)志物，其在肝癌中的潛在價(jià)值也一直被挖掘。研究認(rèn)為，miRNA 參與癌細(xì)胞的發(fā)育與分化，轉(zhuǎn)錄后能夠水平上調(diào)靶基因的表達(dá)。研究表明，miR–22 在肝癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，說(shuō)明miR–22 參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且miR–22 的異常表達(dá)對(duì)肝癌的診斷也存在一定的意義。磷脂酰肌醇–3 激酶（phosphatidylinositol 3–kinase，PI3K）參與增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究表明，P13K 和其下游A 蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）所組成的信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并對(duì)該通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的存活及增殖造成影響。因此，本研究旨在通過(guò)下調(diào)miR–22 以調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路，觀察其對(duì)肝癌大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 研究動(dòng)物

43 只SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠，體重100～120g，平均（110.23±8.42）g；鼠齡6～8 周，平均（7.25±1.25）周，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（陜）2012–003]。所有大鼠均于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)，喂食標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由攝入食水，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，12h 明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)浙江省臺(tái)州醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：tzy–2020166）。

1.2 方法

1.2.1 儀器準(zhǔn)備 離心機(jī)（KH20R–Ⅱ，張家港市駿宇離心機(jī)制造有限公司）；全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（BK–400，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；miRNA提取分離試劑盒（武漢時(shí)勝生物科技有限公司）；蛋白印跡試劑盒（上海羽哚生物科技有限公司）。

1.2.2 肝癌大鼠建模按照完全隨機(jī)分組法選取10 只大鼠作為空白組，余33 只進(jìn)行建模。從傳代Wistar 大鼠腹腔抽取癌性腹水5ml，離心半徑10cm，2000 轉(zhuǎn)/min 離心2min，制成半液態(tài)癌性腹水，放入1ml 注射器內(nèi)備用。于大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300mg/kg）進(jìn)行麻醉后切開(kāi)腹部，暴露腹腔，取離體表最近的肝葉進(jìn)行腫瘤種植。用手指按壓肝葉減少呼吸，注射提前配置好的半液態(tài)癌性腹水，注射量0.05ml。注射完畢后，用棉簽在穿刺點(diǎn)位置按壓3min，觀察有無(wú)活動(dòng)性出血，輕輕將肝臟還納腹腔，逐層關(guān)腹。

1.2.3 分組及干預(yù) 最終成功建模30 只，按照完全隨機(jī)分組法將其分為模型組、上調(diào)miR–22 組、下調(diào)miR–22 組，每組各10 只。通過(guò)Lipofectamine 2000將400nm miR–22 inhibitor 轉(zhuǎn)染到上調(diào)miR–22 組、200nm miR–22 inhibitor 轉(zhuǎn)染到下調(diào)miR–22 組，6h 后將其放入10% Dulbecco 的改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified of Eagle medium，DMEM），置于37℃的CO培養(yǎng)箱中孵育48h，最后使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real–time polymerase chain reaction，qRT–PCR）法對(duì)miR–22 inhibitor 轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行檢測(cè)。模型組、空白組大鼠均給予等體積的0.9%氯化鈉溶液干預(yù)。各組均連續(xù)干預(yù)2 周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 qRT–PCR 法檢測(cè)miR–22 相對(duì)表達(dá)量 取出各組大鼠肝組織，經(jīng)12000 轉(zhuǎn)/min 離心15min，得到標(biāo)本提取液，其余步驟嚴(yán)格按miRNA 提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取細(xì)胞總RNA 后，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，使用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，以U6 作為內(nèi)參基因。引物序列如下：miR–22 上游引物：5′–GCACATGCGAATAAGCTGCCAGTTGAAGAA–3′，下游引物：5′–GACGACCCAGTTATCAGTCCGTTT GGAA–3′；U6 上游引物：5′–GGCCTCTCGAACTTG CGTGTC–3′，下游引物：5′–CCATCGGAAGCTCGTA TACGA–3′。采用2方法計(jì)算miR–22 相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)3 次，取平均值。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo) 采集大鼠腹主動(dòng)脈血3ml，2000 轉(zhuǎn)/min 離心5min（離心半徑5cm），采用BK–400 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）。

1.3.3 病理組織觀察 用安樂(lè)法處死兩組大鼠后取大鼠的肝組織，并對(duì)其進(jìn)行肉眼觀察，對(duì)肝臟病變較為明顯（結(jié)節(jié)大的）的部位進(jìn)行切取，然后平均分為2 份，將其中一份置于10%的福爾馬林溶液中，然后對(duì)其進(jìn)行蘇木精–伊紅染色，使用顯微鏡對(duì)肝組織的形態(tài)進(jìn)一步觀察分析；其中10%～20%為少量，30%～60%為部分，70%～80%為多數(shù)；另一份置于–80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 采用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)PI3K、AKT、p–AKT 含量 對(duì)標(biāo)本提取液進(jìn)行1000轉(zhuǎn)/min 離心處理，離心半徑5cm，離心5min 后對(duì)沉淀物進(jìn)行提取，并將放射免疫沉淀試驗(yàn)（radio immunoprecipitation test，RIPA）裂解緩沖液添加到沉淀物中，對(duì)其在–80℃與40℃的環(huán)境中進(jìn)行反復(fù)凍融后，離心半徑5cm，1000 轉(zhuǎn)/min 離心5min，提取上清液，其余步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果采用LabWorks3.0 軟件以目的條帶β–actin 的灰度值進(jìn)行分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組miR–22 相對(duì)表達(dá)量比較

與上調(diào)miR–22 組比較，模型組、下調(diào)miR–22組大鼠的miR–22 相對(duì)表達(dá)量較低，且下調(diào)miR–22組幅度變化最大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組miR–22 相對(duì)表達(dá)量比較（）

2.2 各組肝功能指標(biāo)比較

與上調(diào)miR–22 組比較，模型組、下調(diào)miR–22組大鼠的TBIL、ALT、ALB 水平表達(dá)較低，且下調(diào)miR–22 組幅度變化最大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組肝功能指標(biāo)比較（）

2.3 各組病理組織觀察

空白組大鼠肝組織正常，肝組織結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)異樣血管出現(xiàn)；下調(diào)miR–22 組大鼠肝組織異常，肝組織結(jié)構(gòu)稍微模糊，少量異樣血管出現(xiàn)；模型組大鼠肝組織異常，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，部分異樣血管出現(xiàn)；上調(diào)miR–22 組大鼠肝組織異常，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，多數(shù)異樣血管出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠病理組織觀察（蘇木精–伊紅染色×200）

2.4 各組大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相對(duì)表達(dá)量比較

與上調(diào)miR–22 組比較，模型組、下調(diào)miR–22組大鼠的PI3K、AKT 水平較低，p–AKT 水平較高，且下調(diào)miR–22 組幅度變化最大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相對(duì)表達(dá)量比較（）

圖2 各組大鼠的p–AKT、PI3K、AKT 表達(dá)水平比較（Western blotting 條帶圖）

3 討論

肝癌會(huì)出現(xiàn)肝內(nèi)散播現(xiàn)象，目前針對(duì)肝癌患者需要一個(gè)有效、安全且方便的治療方法。隨著對(duì)腫瘤的研究，逐漸開(kāi)辟一種新型的通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路及重要的靶分子治療肝癌的途徑，其主要機(jī)制為通過(guò)對(duì)肝癌分子的改變，從而達(dá)到良好的治療效果。

microRNA（miRNA）是一類(lèi)具有調(diào)控功能的非編碼內(nèi)源性小分子RNA。研究證實(shí)，miRNA 在肝癌中具有重要作用，并參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。隨著對(duì)miRNA 的深入研究，發(fā)現(xiàn)它可調(diào)節(jié)多個(gè)原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，還可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，在肝癌組織中，下調(diào)miR–22 可降低TBIL、ALT、ALB 水平，從而對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定的影響作用。分析原因：miR–22 可通過(guò)調(diào)控靶向基因從而實(shí)現(xiàn)激活肝癌細(xì)胞的效果，同時(shí)該因子作為肝癌上皮–間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的啟動(dòng)子，可以靶向植入同結(jié)構(gòu)域蛋白來(lái)轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞，加重肝癌患者的病情。

抑制AKT 活化，促進(jìn)p–AKT 表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤的進(jìn)程，表明AKT 活化與細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均有關(guān)。研究證實(shí)PI3K/AKT 是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和衰老的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR–22 的表達(dá)可使PI3K、AKT 水平降低，p–AKT水平升高。分析原因：p–AKT 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，是PI3K/AKT 信號(hào)通路的主要細(xì)胞周期調(diào)控因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。下調(diào)miR–22 可有效抑制AKT 的活性，通過(guò)去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇，從而激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，引起一系列反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究顯示下調(diào)miR–22 可減少PI3K、AKT、p–AKT 在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。

綜上所述，通過(guò)下調(diào)miR–22 調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路可使大鼠的肝功能得到有效改善，為臨床肝癌靶向治療提供一定的理論依據(jù)，但本研究樣本數(shù)較少，且未對(duì)其關(guān)聯(lián)性進(jìn)行深入研究，仍需多中心大樣本研究進(jìn)行證實(shí)。