呂航 李小冬 劉宏鵬 王順 宿慧

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是骨密度及骨質(zhì)量降低，骨微結構發(fā)生破壞的一種疾病[1]。酒精對骨密度和骨量存在較大影響[2]；酒精能對骨組織的異常代謝進行誘導，對成骨-破骨平衡進行破壞[3]。但目前尚未清楚酒精作用在哪個階段來影響B(tài)MSCs抑成骨/促成脂分化的能力。祖國醫(yī)學認為，酒精性骨質(zhì)疏松癥，以腎虛血瘀為主要病機，以補腎活血法主之[4]。人臍靜脈間充質(zhì)干細胞（human umbilical vein mesenchymal stem cells，hUV-MSCs）來源豐富，具有減輕和消除炎癥、修復組織損傷等多種生物學功能，已越來越多地應用于器官損傷的治療[5]。以往研究顯示酒精對腎虛血瘀型OP的治療有消極作用[6]，但關于酒精對hUV-MSCs治療腎虛血瘀型OP分子機制方面的研究少見?；诖吮狙芯繉⑼ㄟ^動物實驗對此進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康4周齡SD雄性大鼠40只，大鼠重量240～260 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（黑）2019-0004。

1.2 試劑、設備與細胞株

試劑：75%醫(yī)用酒精（生產(chǎn)廠家：山東朱氏藥業(yè)集團有限公司，批準文號：魯衛(wèi)消證字2015第1603號，配置為20%濃度）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）ELISA檢測試劑盒均購自北京博奧派克生物科技有限公司。

儀器：酶標儀（生產(chǎn)廠家：上海賽默科技生物發(fā)展有限公司，型號：DP-6100）；-80 ℃超低溫冰箱（生產(chǎn)廠家：日本SANYO三洋電機，型號：MDF-C8V）；光學顯微鏡（生產(chǎn)廠家：日本奧林巴斯，型號：STT-300）；熒光顯微鏡（生產(chǎn)廠家：日本奧林巴斯，型號：LF50）；臺式高速冷凍離心機（生產(chǎn)廠家：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H2050R）。

細胞株：人臍帶間充質(zhì)干細胞hUV-MSCs，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3 動物造模及分組

采用酒精腹腔注射法制備腎虛血瘀型OP大鼠模型，造模成功后將SD大鼠隨機分為酒精組、治療組和對照組，每組10只。酒精組尾靜脈注射酒精 [20%，10 ml/（kg·次），1次 /周 ]，對照組在酒精組基礎上尾靜脈注射hUV-MSCs（1次/周，107個細胞/次），治療組停止酒精注射但尾靜脈注射注射 hUV-MSCs（1次 /周，107個細胞 /次）；取SD大鼠10只腹腔注射法生理鹽水作為假手術組，尾靜脈注射生理鹽水 [10 ml/（kg·次），1次 /周 ]。四組均連續(xù)治療8周。

1.4 觀察指標

處死大鼠后，取大鼠腰椎骨進行以下檢測：（1）采用HE染色對大鼠骨組織的病理損傷情況進行檢測，觀察骨小梁面積變化。（2）采用TUNEL染色檢測觀察骨組織細胞凋亡情況，熒光顯微鏡觀察FITC標記的TUNEL陽性細胞并拍照。（3）采用醫(yī)學顯微CT檢測骨組織的骨體積分數(shù)（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分離距離（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）。（4）采用 ELISA 檢測血清ALP和TRAP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組骨組織病理損傷的比較

假手術組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積分別為（71.25±3.64）%、（38.19±2.57）%、（52.10±2.76）%、（56.31±2.90）%，四組大鼠骨組織骨小梁面積比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=206.5，P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積均小于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積均大于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織骨小梁面積大于對照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織病理學HE染色情況，見圖1。

圖1 四組大鼠骨組織病理學HE染色情況（×100）

2.2 四組骨組織細胞凋亡情況比較

假手術組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織 TUNEL陽性細胞數(shù)分別為（5.16±1.08）、（36.29±2.43）、（27.18±2.05）、（24.71±2.36），四組比較大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=407.5，P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)均多于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)均少于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)明顯少于對照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片，見圖2。

圖2 四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片（×200）

2.3 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較

四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均低于假手術組（P＜0.05），Tb.Sp均高于假手術組（P＜0.05）；治療組與對照組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于酒精組（P＜0.05），Tb.Sp均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于對照組（P＜0.05），Tb.Sp低于對照組（P＜0.05），見表 1。

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

*與假手術組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對照組比較，P＜0.05。

組別 BVF（%） Tb.Th（mm） Tb.Sp（mm）假手術組（n=10） 31.60±2.98 0.079±0.003 0.13±0.04酒精組（n=10） 8.42±1.05* 0.034±0.002* 0.65±0.07*對照組（n=10） 17.53±2.14*# 0.048±0.005*# 0.54±0.06*#治療組（n=10） 20.90±2.36*#△ 0.060±0.007*#△ 0.26±0.03*#△F值 175.8 167.2 235.0 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組血清ALP和TRAP水平比較

四組血清ALP與TRAP水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。酒精組、對照組、治療組大鼠血清ALP與TRAP水平均高于假手術組（P＜0.05），治療組與對照組大鼠血清ALP與TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨血清ALP與TRAP水平均低于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

*與假手術組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對照組比較，P＜0.05。

組別 ALP（U/L） TRAP（pg/ml）假手術組（n=10） 17.36±2.48 14.30±1.69酒精組（n=10） 60.17±3.95* 35.72±3.68*對照組（n=10） 41.60±2.72*# 26.47±2.16*#治療組（n=10） 33.80±2.49*# △ 21.05±2.24*# △F值 357.5 125.6 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

酒精性OP是繼發(fā)性OP，是指因人體長期大量飲酒引起骨量丟失，骨微觀結構退化致使骨脆性增加的一種全身性骨骼疾病[6]。長期慢性飲酒可致多種疾病發(fā)生，酒精可干擾骨代謝，損害骨骼系統(tǒng)引起骨質(zhì)疏松，導致骨折，為家庭帶來沉重經(jīng)濟負擔[7]。hUV-MSC能分化成為中胚層間質(zhì)組織，具備自我更新及多向分化的潛能。hUV-MSCs來源豐富、取材操作方便、不涉及倫理學問題，能促進成骨細胞的增殖活性[8]。國外學者通過構建骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠模型，探討臍帶間充質(zhì)干細胞的治療效果，結果顯示骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠骨再生明顯增強，成骨細胞數(shù)量增高[9]。

以往有研究顯示，長期酒精攝入可導致大鼠骨小梁數(shù)量減少、間隙增大、厚度降低，使骨骼彈性模量、最大載荷及破壞載荷等生物力學性能降低，骨骼抵抗外力性能下降，骨折風險明顯增加[10]；還有研究顯示，酒精可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞ROS水平及自噬水平升高，抑制成骨而促進成脂分化[11]。本研究結果顯示，酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均低于假手術組，骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均高于假手術組（P＜0.05）；治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于酒精組，骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于對照組，骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于對照組（P＜0.05）。提示酒精對hUV-MSCs治療OP大鼠有消極的影響。ALP是堿性磷酸的一種同工酶，由成骨細胞產(chǎn)生，是成骨細胞成熟和具有活性的標志，對了解成骨細胞的狀態(tài)有重要意義。隨著OP病情的進展ALP水平逐漸升高，表明其與骨質(zhì)疏松有密切的關系[12-13]。TRAP過度表達的大鼠模型表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。骨吸收時，破骨細胞附著在骨的表面，分泌的酸和蛋白酶在骨基質(zhì)與破骨細胞之間形成一個空隙，磷酸酐酶和H+-ATP酶質(zhì)子泵形成一個酸性環(huán)境，位于破骨細胞微粒體TRAP，即通過破骨細胞波狀緣分泌進入此空隙，與其他酶一起參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解[14-15]。

綜上所述，酒精影響hUV-MSCs成骨/成脂分化平衡，進而影響了其在腎虛血瘀型OP中的治療效果。