曾周杰，于 雯，仇浩謙，陳文娟，張立紅

[中國石油大學(華東) 理學院，山東 青島 266580]

光學顯微技術(shù)對人類探索微觀世界具有重要意義，在細胞生物學、醫(yī)學、物理學、化學等領(lǐng)域具有廣泛應用。傳統(tǒng)顯微系統(tǒng)主要由光源，透鏡組及光電傳感器等多個部件組成，結(jié)構(gòu)復雜，價格昂貴[1]。其中，物鏡是顯微系統(tǒng)中至關(guān)重要的一環(huán)，但因為其固定空間帶寬積，往往無法同時實現(xiàn)高分辨率與大視場成像。以對大面積病理樣本成像為例，需要進行染色、冷凍、切片、掃描和拼接[2]。在此過程中，又需要對多幅小視場圖片進行預處理，圖像的配準和融合通常存在準確性低、耗時長等問題[3,4]。

而近年來，隨著優(yōu)良圖像傳感器和高性能計算機的出現(xiàn)，無透鏡成像技術(shù)迅速發(fā)展。該技術(shù)不僅可以克服傳統(tǒng)光學顯微鏡固定分辨率-視場積的限制，無像差，且具有結(jié)構(gòu)簡單，便攜性高和成本低等優(yōu)點[5-8]。目前無透鏡成像技術(shù)分為無透鏡陰影成像[9]、無透鏡熒光成像[10]和無透鏡全息成像[7]三種[1]。其中，無透鏡全息成像因其高分辨率和簡潔的成像流程而具有廣泛應用前景。無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)通常由光源、樣品臺以及光電探測器組成。成像過程中，光源中的LED光經(jīng)過微孔傳播一段距離后照射至樣本，發(fā)生衍射后的衍射圖案最后被下方的光電傳感器所記錄。計算機根據(jù)光電傳感器所記錄的圖像，利用圖像恢復算法進行重建，最終得到樣本的再現(xiàn)像。目前常用的重建算法主要有菲涅爾積分法[11]、卷積法[12]、角譜法[13]等。

針對現(xiàn)有無透鏡裝置自動化程度低的缺點，搭建了一套無透鏡智能顯微成像裝置，系統(tǒng)硬件部分由1W高功率藍光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2 600萬像素、視場為57.1 mm2的CMOS相機、兩部兩相四線精密步進電機、STM32F4VE單片機、可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊和暗箱組成，軟件部分由電腦端上位機組成。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對生物樣品的大視場顯微成像，及對圖像視野的自適應智能調(diào)整，具有自動化程度高的優(yōu)點，不僅可用于對生物樣品的大視場顯微成像，還可應用于無透鏡成像的教學演示實驗及科普演示實驗。

1 成像原理

全息圖像恢復的主要算法有菲涅耳積分法、卷積法及角譜法。其中，角譜法恢復過程計算量較小，故選用角譜法進行全息圖的恢復。

無透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理如圖1所示，微孔與樣品的距離為Z1，樣品與CMOS相機的距離為Z2。利用微孔提高光源相干性，使光源經(jīng)過Z1距離的傳播后，照射到樣品上的光為近似相干光。照射至樣品時，通過樣品的光可分為兩種，一種是經(jīng)過樣品的光，其攜帶樣品部分信息，被稱為物光；另一種是透過玻片，未經(jīng)樣品的光，被稱為參考光。這兩部分光相互干渉，形成的干涉圖案被下方的CMOS相機記錄，并傳入電腦端上位機。

圖1 無透鏡智能顯微成像系統(tǒng)原理圖

(1)

其中，α和β為空間頻譜的方位角。

因此，U與Uo的關(guān)系可表示為：

U=-1{{Uo}Hz}

(2)

對全息圖U進行二維傅里葉變換求出CMOS圖像傳感器平面處的角譜A后，代入波長等參數(shù)并乘以該傳播函數(shù)Hz，即可得到樣品平面處的角譜Ao，對求得的角譜做二維傅里葉變換，即可求得樣品平面處的光場分布Uo。圖像重建流程如圖2所示。

圖2 圖像重建流程圖

2 裝置組成

圖3為無透鏡智能顯微成像裝置示意圖。

圖3 無透鏡智能顯微成像裝置示意圖

裝置從上到下依次為無透鏡成像模塊、自適應位移臺及可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊。

其中，無透鏡成像模塊包括：1W高功率藍光LED光源、直徑為50 μm的精密針孔和單像素尺寸為1.335 μm、2 600萬像素、視場為57.1 mm2的CMOS相機；自適應位移臺包括：兩部垂直放置的兩相四線精密步進電機、兩部低熱量步進電機驅(qū)動器和STM32F4VE單片機；可調(diào)降壓穩(wěn)壓電源模塊包括：LM2596S DC-DC直流可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊及1 800 mAh3S航模電池。另外，為滿足無透鏡成像需要，裝置還設(shè)計了配套暗箱。無透鏡智能顯微成像裝置實物圖如圖4所示。

圖4 無透鏡智能顯微成像裝置實物圖

裝置工作時，無透鏡成像模塊中的LED作為光源向下照射樣品，其干涉圖像被樣品下方的CMOS所記錄并傳至電腦端上位機(其界面如圖5所示)，電腦端上位機實時顯示CMOS所記錄圖像。當電腦端上位機執(zhí)行成像視野自適應調(diào)整操作時，其根據(jù)CMOS所成圖像計算并向STM32F4VE單片機發(fā)送指令。單片機根據(jù)指令控制步進電機運動，從而完成對成像視野的自適應調(diào)整。調(diào)整至合適視野后，電腦端上位機可實現(xiàn)當前圖像的實時重建與保存。

圖5 電腦端上位機界面

3 自適應位移臺及其算法設(shè)計

3.1 自適應位移臺設(shè)計

自適應位移臺包括兩部運動方向垂直放置的步進電機、下方的STM32F4VE單片機、兩部低熱量步進電機驅(qū)動器以及可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊，圖6為自適應位移臺部分示意圖，圖7為位移臺控制圖。通過兩部運動方向垂直放置的步進電機，CMOS能夠?qū)崿F(xiàn)x-y方向的水平位移。其中，兩部步進電機驅(qū)動器設(shè)置為800細分，精度為1.25 μm每步。

圖6 自適應位移臺部分示意圖

圖7 位移臺控制圖

在單片機收到電腦端上位機的指令后，根據(jù)指令中的步數(shù)標志向步進電機驅(qū)動器的脈沖正接口輸出相應數(shù)目的脈沖精確控制步進電機的運動步數(shù)；根據(jù)指令中的方向標志向步進電機驅(qū)動器的方向負接口輸出對應的高低電平控制步進電機運動的方向。步進電機滑塊與CMOS相機固定，從而帶動CMOS相機進行水平位移，實現(xiàn)成像視野的自適應智能調(diào)整。

3.2 自適應視野調(diào)整算法設(shè)計

在自適應調(diào)整時，首先進行圖像處理。圖像處理過程中，首先將CMOS相機采集到的圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，得到灰度圖像后對灰度圖像進行邊緣識別。邊緣識別使用Prewitt算子，該算子是一種一階微分算子。對于離散的二維圖像，其水平和垂直方向的梯度為：

(3)

因為圖像的離散性，上式可化簡為：

(4)

其中f(x,y) 代表(x,y)處的灰度值。

根據(jù)上述原理，Prewitt算子利用3×3的梯度模板，對整幅圖像進行梯度運算，在邊緣處，其灰度值變化大，梯度大，從而提取出圖像中的邊緣信息。

邊緣識別后，圖像相當于經(jīng)過二值化處理，數(shù)據(jù)量大大減小，此時顯示的便是樣品的邊緣。對此時圖像邊緣的所有像素點的坐標進行加權(quán)平均：

(5)

其中fi代表第i個點的灰度值，xi代表第i個點的x坐標，yi代表第i個點的y坐標。

每一個像素點的權(quán)數(shù)為該點的灰度值，最后除以邊緣像素點的個數(shù)，從而得到樣品的幾何中心坐標(xc,yc)。圖像處理示意圖如圖8所示。

圖8 圖像處理示意圖

裝置所用的CMOS相機，其在上位機顯示畫面的尺寸為1 920×1 080，因此畫面中心的坐標為(960,540)。將所求得的樣品中心坐標(xc,yc)與畫面中心坐標(960,540)作差，可得位移臺步數(shù)為：

stepx=xc-960

stepy=yc-540

(6)

其中stepx，stepy為兩個整數(shù)，其絕對值分別代表x及y方向步進電機移動步數(shù)，其正負代表x及y方向步進電機移動方向。

得到上述信息后，進行判斷并生成指令，根據(jù)步進電機擺放方式，若stepx>0則x方向位移臺的方向標志為1，反之方向標志為2；若stepy>0則y方向位移臺的方向標志為2，反之方向標志為1。對stepx和stepy取絕對值，若其中有一項大于99 999，則設(shè)置二次位移標志為1，大于99 999的那一項設(shè)置為99 999。若二次位移標志為1，則位移臺完成位移動作后，上述流程將再次重復，直至一次位移便能將樣品幾何中心移至視野中心，從而完成視野的自適應調(diào)整。自適應算法流程圖如圖9所示。

圖9 自適應算法流程圖

3.3 指定中心視野調(diào)整算法設(shè)計

指定中心視野調(diào)整模式下，當鼠標點擊上位機界面攝像頭實時畫面視窗某點時，裝置將自動將該點移至視野中央，實現(xiàn)指定中心視野調(diào)整。指定中心視野調(diào)整算法流程圖如圖10所示。

圖10 指定中心視野調(diào)整算法流程圖

該算法首先獲取點擊像素點的坐標(xg,yg)，將其與畫面中心坐標(960,540)作差，可得位移臺步數(shù)為：

(7)

其中stepx包含x方向步進電機移動的方向和步數(shù)，stepy包含y方向步進電機移動的方向和步數(shù)。

重復3.2節(jié)中生成指令流程，并向單片機發(fā)送指令，控制位移臺動作，從而將鼠標點擊像素點移至視野中央，實現(xiàn)指定中心的視野調(diào)整。

4 裝置測試

裝置測試中，選取椴樹莖及水蚤進行成像。椴樹莖和水蚤成像圖如圖11、12所示。

(a)椴樹莖干涉圖樣

(a)水蚤干涉圖樣

由圖11、12可見，裝置能夠很好分辨椴樹莖的外形輪廓、內(nèi)部細節(jié)及水蚤胸肢、殼刺等，具有良好成像能力，能夠滿足教學及演示實驗需求。

5 結(jié) 語

針對傳統(tǒng)光學顯微鏡固定分辨率-視場積的局限，研究人員提出無透鏡顯微鏡，但現(xiàn)有無透鏡顯微裝置大多結(jié)構(gòu)固定，自動化，智能化程度低。針對以上問題，設(shè)計了一套無透鏡智能顯微成像裝置。測試表明，該裝置不僅可實現(xiàn)大市場較高分辨率顯微成像，且配合自適應位移臺能夠?qū)崿F(xiàn)對成像視野的自適應調(diào)整，結(jié)構(gòu)簡單，經(jīng)濟效益高，自動化程度高。