王晨亮 張 菁 劉浩茹 李觀華

江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，江西九江 332000

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細胞肺癌的主要亞型之一，是惡性程度最高的癌癥之一，通常在晚期被診斷出，臨床預后較差，5年生存率低。研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解與非小細胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并受到Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcoma viral oncogene homolog，KRAS）的調(diào)控，KRAS 是引發(fā)肺癌的關(guān)鍵基因之一，近年來針對KRAS 為分子治療靶點的研究越來越多。烏骨藤總苷是烏骨藤輔助抗癌的主要成分，對胃癌、肉瘤、白血病、肝癌等腫瘤具有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，復方烏骨藤膠囊對Lewis 肺癌小鼠具有抑瘤作用, 并能夠增強其腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性，從而提高荷瘤小鼠的免疫功能。目前關(guān)于烏骨藤總苷的研究還較少，烏骨藤總苷的一些作用機制也尚不明確，本研究主要就烏骨藤總苷對肺癌細胞的影響及機制進行研究，為烏骨藤總苷的進一步開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人非小細胞肺癌細胞NCI-H1299 購自ATCC。將H1299 細胞置于37℃、5% CO的培養(yǎng)箱中，使用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RMPI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。及時更換培養(yǎng)液，當細胞融合度達到80%～90%時用胰酶消化后進行傳代。

1.2 儀器與試劑

烏骨藤總苷（自制，C21 甾體苷類成分含量＞80%）；MTT 噻唑藍（北京索萊寶科技有限公司，批號：303HO510）；二甲基亞砜（上海鈺博生物科技有限公司，貨號：YB60313ES60）；RPMI 1640 培養(yǎng)基[愛必信（上海）生物科技有限公司，貨號：abs9468]；葡萄糖定量試劑盒（美國AAT Bioquest 公司，貨號：AAT-40004）；胎牛血清[愛必信（上海）生物科技有限公司，批號：190A19]；Trizol（上海研卉生物科技有限公司，批號：50175111）；磷酸緩沖鹽溶液（上海梵態(tài)生物科技有限公司，貨號：FT21046yy）；通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司，貨號：RE0510-50T]；Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ乳酸試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號：K627-100）；KRAS 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab275876）；GAPDH（5174）、Bax 抗體（5023）、Bcl-2 抗體（3498）、LC3A/B 抗體（4108）、beclin-1 抗體（3495）、HRP 標記的羊抗兔二抗（7074）均購于美國Cell Signaling Technology 公司。熒光定量PCR 儀（美國伯樂Bio-rad 公司，型號：CFX96Touch）；全自動凝膠成像分析儀（上海鄂禾儀器有限公司，型號：SH-EHE-288）；多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Varioskan LUX）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：CytoFLEX）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與處理 取對數(shù)生長期的H1299 細胞，隨機分為對照組、烏骨藤總苷低劑量組、烏骨藤總苷高劑量組、 烏骨藤總苷+Vector 組和烏骨藤總苷+KRAS 組。烏骨藤總苷低劑量組和烏骨藤總苷高劑量組分別用終濃度為5、20 mg/ml 的烏骨藤總苷處理H1299 細胞； 烏骨藤總苷+Vector 組先轉(zhuǎn)染陰性對照載體，再用20 mg/ml 的烏骨藤總苷處理； 烏骨藤總苷+KRAS 組先轉(zhuǎn)染KRAS 過表達載體，再用20 mg/ml的烏骨藤總苷處理；對照組不轉(zhuǎn)染，用正常培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測各組H1299 細胞KRAS 表達水平 取各組生長狀態(tài)良好的細胞，吸棄培養(yǎng)液，胰酶消化后離心，將細胞用PBS 清洗后離心，收集細胞。用Trizol 法提取細胞總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用qRT-PCR 法檢測KRAS 的相對表達水平，所用引物為：F：5′-CCA ATTGTGAATGTTGGTGTG-3′，R：5′-CCAATTAGA AGGTCTCAACTG-3′。根據(jù)2的方法計算目的基因的相對表達水平。

1.3.3 MTT 檢測各組H1299 細胞增殖抑制率 將各組細胞接種于96 孔板中，每組3 次重復。在每孔中加入MTT 20 μl，37℃下培養(yǎng)4 h，棄上清液，然后再加入150 μl 的二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，充分混勻，使用酶標儀在490 nm 波長處測定各孔的吸光值（optical density，OD），實驗重復3 次。細胞抑制率計算公式為： 細胞抑制率=對照組OD－處理組OD/空白對照組OD×100%。

1.3.4 葡萄糖消耗量和乳酸含量 取各組細胞離心，收集細胞上清液，葡萄糖消耗量使用葡萄糖定量試劑盒進行檢測，采用Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ乳酸試劑盒檢測細胞培養(yǎng)基中的乳酸含量，具體實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測各組H1299 細胞凋亡率 取各組細胞，加入胰酶消化，棄上清液，加入PBS 液洗滌2次，離心收集細胞，轉(zhuǎn)移至EP 管中，加入200 μl 1×的結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后在細胞懸液中加入5 μl的Annexin V 和5 μl 碘化丙錠（propidine iodide，PI）混勻，避光反應15 min，流式細胞儀上樣檢測各組細胞凋亡情況。實驗重復3 次。

1.3.6 Western blot 檢測KRAS 蛋白和凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達水平 將已棄去培養(yǎng)液的細胞用預冷的PBS 清洗3 次，加入蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA 法對提取的蛋白質(zhì)進行定量檢測。用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液：KRAS（1∶1 000），Bcl-2（1∶1 000），Bax（1∶1 000），LC3A/B（1∶1 000）和beclin-1（1∶2 000），4℃冰箱過夜。回收一抗，TBST 洗膜后，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜，采用增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑顯影，拍照并進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組H1299 細胞KRAS 表達水平的比較

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組KRAS mRNA和KRAS 蛋白表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。烏骨藤總苷高劑量和烏骨藤總苷+Vector組KRAS mRNA 和KRAS 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組KRAS mRNA 和KRAS 蛋白表達水平高于烏骨藤總苷+Vector組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖1，表1）。

圖1 Western blot 檢測各組H1299 細胞KRAS 表達水平

表1 各組H1299 細胞KRAS 表達水平比較（n=9，±s）

2.2 各組H1299 細胞增殖水平的比較

烏骨藤總苷不同劑量組細胞增殖抑制率均高于對照組，克隆形成數(shù)均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組細胞增殖抑制率低于烏骨藤總苷+Vector 組，克隆形成數(shù)高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2，表2）。

表2 各組H1299 細胞增殖水平比較（n=9，±s）

圖2 各組H1299 細胞克隆形成情況

2.3 各組H1299 細胞糖酵解水平的比較

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組的葡萄糖消耗量和乳酸含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；烏骨藤總苷+KRAS 組葡萄糖消耗量和乳酸含量高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表3）。

表3 各組H1299 細胞葡萄糖消耗量和乳酸含量的比較（n=9，±s）

2.4 各組H1299 細胞凋亡水平的比較

烏骨藤總苷不同劑量組細胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組細胞凋亡率低于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3，表4）。

表4 各組H1299 細胞凋亡水平的比較（n=9，±s）

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組H1299 細胞凋亡率

2.5 各組H1299 細胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白表達水平

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組Bax、LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1 蛋白水平高于對照組，Bcl-2 蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組Bax、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白水平低于烏骨藤總苷+Vector 組，Bcl-2 蛋白水平高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。烏骨藤總苷高劑量組和烏骨藤總苷+Vector 組的蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4，表5）。

圖4 Western blot 檢測各組H1299 細胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白表達

表5 各組H1299 細胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白表達水平比較（n=9，±s）

3 討論

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其病因結(jié)構(gòu)復雜，早期很難發(fā)現(xiàn)且轉(zhuǎn)移性高，在全球范圍內(nèi)都表現(xiàn)出高發(fā)病率和高死亡率。肺癌主要有兩種：小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在原發(fā)性肺癌中的占比更大，約占85%。烏骨藤又名通關(guān)藤，為蘿藦科多年生攀援植物，主要以干燥藤莖入藥，具有祛風濕、通經(jīng)活血、止血等作用?，F(xiàn)代研究表明，烏骨藤提取物對多種腫瘤細胞的增殖都具有良好的抑制作用，且毒副作用小。

KRAS 是非小細胞肺癌中一種最常見的突變基因，約20%～30%的非小細胞肺癌存在KRAS 突變。研究發(fā)現(xiàn)，當KRAS 基因發(fā)生突變，會導致其編碼的蛋白持續(xù)活化，進而激活MAPK 信號通路、AKT 信號通路等下游信號通路，驅(qū)動細胞生長和增殖。周琳等在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，Adagrasib 作為一種針對KRAS G12C 突變的口服小分子共價抑制劑，對NSCLC 治療方案起到了補充作用，且不良反應少，耐受性較好，是一種具有潛力的NSCLC 治療藥物。本研究結(jié)果顯示，烏骨藤總苷可明顯抑制KRAS 的表達水平，且當KRAS 過表達時肺腺癌細胞增殖抑制率和細胞凋亡率會明顯降低，提示烏骨藤總苷可能通過抑制KRAS 的表達抑制肺腺癌細胞的生長和增殖，且抑制作用會隨著烏骨藤總苷所用劑量的升高而增強。

腫瘤細胞即使是在氧氣充足的條件下亦表現(xiàn)出明顯的糖酵解活性，消耗大量葡萄糖并產(chǎn)生乳酸，此種異常代謝現(xiàn)象被稱為Warburg 效應，Warburg 效應在大多數(shù)惡性腫瘤細胞中均存在，可以為腫瘤細胞提供大量增殖所需的能量，還可以提供對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有利的酸性環(huán)境，因此抑制糖酵解水平可在一定程度上發(fā)揮抗癌作用。本研究通過檢測各組細胞的葡萄糖消耗量和乳酸含量可以發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的烏骨藤總苷對肺腺癌細胞的糖酵解過程具有抑制作用，可以明顯抑制肺腺癌細胞的Warburg 效應，減少腫瘤細胞能量供給，從而抑制腫瘤細胞的增殖能力。郭舜等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可同時參與肝癌細胞糖酵解及谷氨酰胺代謝從而抑制肝癌細胞的增殖降低肝癌細胞能量代謝水平。且研究發(fā)現(xiàn)，DEPDC1 可能通過調(diào)節(jié)KRAS/MEK/ERK 信號通路來影響糖酵解，進而影響肝細胞癌進展。上述實驗結(jié)果與本文結(jié)果具有一致性。

腫瘤細胞往往具有無限復制潛能、凋亡抵抗等能力，因此誘導腫瘤細胞凋亡和自噬也是治療腫瘤的重要策略之一。Bcl-2 家族蛋白是在凋亡過程中起重要作用的蛋白家族，其中Bax 有促進細胞凋亡的作用，而Bcl-2 具有抗凋亡作用。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和beclin-1 是參與調(diào)控細胞自噬過程的重要蛋白，Beclin-1 是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子，在自噬起始階段起關(guān)鍵作用；LC-3 是自噬體膜的標記物，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，且LC3-Ⅱ含量的多少在某種程度上反映了細胞的自噬活性。在本研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組對肺腺癌細胞凋亡和自噬過程的相關(guān)蛋白具有調(diào)控作用，且過表達KRAS 時會反轉(zhuǎn)烏骨藤總苷的作用效果，即烏骨藤總苷可能通過調(diào)控KRAS 的表達從而對凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達起調(diào)控作用，促進肺腺癌細胞的凋亡和自噬，從而控制腫瘤細胞數(shù)量。

綜上所述，烏骨藤總苷可以通過抑制KRAS 的表達，調(diào)控肺腺癌細胞的糖酵解、凋亡和自噬過程，從而對肺腺癌細胞的增殖起到抑制作用，且烏骨藤總苷對肺腺癌細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。