盧庭婷 梁惠萍 陳基強 譚麗麗

(廣西衛(wèi)生職業(yè)技術學院，廣西南寧市 530021)

乳腺癌是女性最常見的一類惡性腫瘤，流行病學調查顯示全球范圍內每年有接近40萬人死于乳腺癌。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，嚴重影響我國婦女的身體健康[1]。目前關于該病的具體發(fā)病機制尚未完全明確，研究顯示其發(fā)生發(fā)展與遺傳和環(huán)境等因素及基因多態(tài)性有關[2-3]。人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)基因位于第6號染色體短臂上，是人類基因組中最復雜的遺傳多態(tài)性基因體系，共包括Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類三個基因區(qū)，其中HLA-Ⅱ類基因包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP及一些與抗原處理和提呈相關的基因。本研究團隊此前已發(fā)現HLA-DQB1基因與肝癌、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關[4-5]。近期相關報道顯示，乳腺癌的發(fā)生可能與HLA-DR/DQ基因多態(tài)性相關，患者體內存在易感基因或保護基因[6-7]。為此，本研究采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物法及基因測序技術檢測HLA-DRB1/DQB1基因多態(tài)性，分析其與廣西壯族女性乳腺癌患者遺傳易感性的關系，以期為該地區(qū)乳腺癌的防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年11月至2021年9月廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院收治的90例乳腺癌患者為乳腺癌組，另選取同時期同一地區(qū)的85例健康體檢者為健康體檢組，所有入選對象均為廣西壯族女性。乳腺癌組患者年齡38～64(42.58±12.09)歲，健康體檢組年齡35～68(44.29±11.82)歲。兩組研究對象的基本資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)乳腺癌組患者為首次經病理學檢查確診為乳腺癌；(2)所有研究對象間無血緣關系；(3)精神狀態(tài)正常，能順利配合研究。排除標準：(1)合并其他腫瘤病史；(2)健康體檢組體檢者既往有乳腺疾病史；(3)合并自身免疫和血液系統(tǒng)疾??；(4)有遺傳病家族史；(5)重要器官功能障礙。本研究經我院學術倫理委員會批準，所有研究對象對本研究知情且同意。

1.2 方法

1.2.1 白細胞DNA的提取與純度檢測 采集患者晨起空腹肘靜脈血2 mL置于抗凝管內，加入2倍體積的細胞分離液，以1 500 r/min離心30 min，取上層白細胞并用磷酸緩沖鹽溶液清洗2遍，采用酚氯仿法提取細胞中的DNA。然后取少量DNA樣本，測定DNA在波長為230 nm、260 nm、280 nm處的吸光度值(A)，如果A260/A280>1.7、A260/A230>2.0，則所取DNA標本的純度合格，否則需再次采集標本。

1.2.2 HLA-DRB1基因分型檢測 選擇天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司生產的HLA-DR基因分型低分辨測定試劑盒進行基因分型檢測，使用德國耶拿公司的高速PCR擴增儀進行基因擴增。再通過基因測序技術對有意義的等位基因進行亞型分型。

1.2.3 HLA-DQB1基因分型檢測 選用天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司生產的HLA-DQ基因分型高分辨測定試劑盒，按照試劑盒說明書進行PCR擴增，擴增結束后，取6 μL擴增產物，使用2%(含核酸染色劑Gold View 0.1 μg/mL)的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳時間為25 min，然后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下成像，根據試劑盒說明書中的結果分型表來判讀基因分型情況。

1.3 觀察指標 統(tǒng)計并計算兩組等位基因頻率(allele frequency，AF)。AF代表某個基因位點上某種特定等位基因與該位點上所有基因總數之間的比率，AF=X/2n(X代表某種等位基因在這一群體中的數目，n代表為這一群體的總例數)。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。兩組間AF的比較采用χ2檢驗，采用95%置信區(qū)間(95%CI)和比值比(OR)分析HLA-DRB1和HLA-DQB1與乳腺癌發(fā)病危險度間的關系，得到的P值采用Bonferroni法校正，記為Pc。以Pc<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HLA-DRB1等位基因多態(tài)性頻率比較 乳腺癌組和健康體檢組均檢出13種HLA-DRB1等位基因，其中乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF為6.1%(11/180)，健康體檢組HLA-DRB1*01 的AF為1.8%(3/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF高于健康體檢組(Pc=0.014，OR=3.345)。乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF為3.9%(7/180)，健康體檢組HLA-DRB1*16的AF為9.4%(16/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF低于健康體檢組(Pc=0.004，OR=0.418)。兩組間其他類型HLA-DRB1的AF比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均Pc>0.05)。見表1。

表1 兩組受檢者HLA-DRB1等位基因多態(tài)性頻率比較

2.2 HLA-DRB1相關等位基因亞型頻率比較 通過基因測序對HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*16進行等位基因亞型分型并進行頻率比較，兩組HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*16均檢出兩種等位基因亞型。其中，乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF為4.4%(8/180)，健康體檢組HLA-DRB1*0102的AF為0.6%(1/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF高于健康體檢組(Pc=0.026，OR=8.519)；乳腺癌組HLA-DRB1*1602的AF為2.2%(4/180)，健康體檢組HLA-DRB1*1602的AF為7.1%(12/170)，乳腺癌組HLA-DRB1*1602的AF低于健康體檢組(Pc=0.013，OR=0.144)。見表2。

表2 兩組受檢者HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*16等位基因亞型頻率比較

2.3 HLA-DQB1等位基因多態(tài)性頻率比較 乳腺癌組和健康體檢組均檢出14種HLA-DQB1等位基因，其中乳腺癌組HLA-DQB1*0201 的AF為38.9%(70/180)，健康體檢組HLA-DQB1*0201的AF為14.1%(24/170)，乳腺癌組HLA-DQB1*0201的AF明顯高于健康體檢組(Pc=0.016，OR=3.381)。兩組其他類型HLA-DQB1的AF比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均Pc>0.05)。見表3。

表3 兩組受檢者HLA-DQB1等位基因多態(tài)性頻率比較

3 討 論

乳腺癌是全球范圍內最常見的一類惡性腫瘤，嚴重影響女性患者的身心健康。國際癌癥中心預測，到2040年全球約有300萬乳腺癌患者[8]。目前關于乳腺癌的具體發(fā)病機制尚未完全明確，但隨著對腫瘤分子基因研究的不斷深入，遺傳因素已被確定與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，尋找與乳腺癌遺傳易感性有關的基因，對從基因水平上認識乳腺癌的發(fā)病機制及制訂有效的乳腺癌防治策略具有重要的臨床意義。HLA是反映機體免疫系統(tǒng)功能的重要指標，其能夠介導抗原呈遞至細胞表面，使機體T淋巴細胞識別內源性抗原肽，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。HLA-Ⅱ類區(qū)域中幾乎所有的基因均代表免疫相關功能，承擔著免疫應答的物質基礎，HLA-Ⅱ類分子在抗原識別、免疫應答及病毒清除這一系列過程中具有重要作用，與許多感染性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。HLA等位基因存在多態(tài)性，HLA-DR/DQ基因的多態(tài)性是免疫抗原多態(tài)性的決定性因素，可影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展[10-11]。研究發(fā)現HLA等位基因的多態(tài)性與乳腺癌的易感性相關，但由于HLA在不同種族、不同地域人群中的分布各不相同，因此不同地區(qū)學者得出的研究結論也不盡相同[6-7,12]。研究顯示，在意大利中部人群中乳腺癌與HLA-DRB1*11:01和HLA-DRB1*10:01 AF增加有關[6]。而非洲布基納法索的學者則未發(fā)現攜帶HLA-DRB1*11和HLA-DRB1*12等位基因與乳腺癌風險之間存在直接關聯[13]。廣西是一個多民族聚居的地區(qū)，其中壯族人口約占全區(qū)戶籍總人口的31.36%，廣西壯族人群的遺傳背景與我國其他民族和地區(qū)有顯著的差別。因此，其他種族和地區(qū)的研究可能并不適用于廣西婦女。

本研究通過聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術擴增乳腺癌患者和健康體檢者的HLA-DRB1、HLA-DQB1基因，并測定其核酸序列，比較兩組受檢者不同等位基因的基因頻率。結果顯示兩組受檢者均檢出13種HLA-DRB1等位基因、14種HLA-DQB1等位基因。乳腺癌組HLA-DRB1*01的AF為6.1%(11/180)，高于健康體檢組的1.8%(3/170)(Pc=0.014，OR=3.345)；乳腺癌組HLA-DRB1*16的AF為3.9%(7/180)，低于健康體檢組的9.4%(16/170)(Pc=0.004，OR=0.418)；乳腺癌組HLA-DQB1*0201的AF為38.9%(70/180)，高于健康體檢組的14.1%(24/170)(Pc=0.016，OR=3.381)。進一步分析HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*16兩種等位基因亞型，結果顯示乳腺癌組HLA-DRB1*0102的AF高于健康體檢組(Pc=0.026，OR=8.519)，HLA-DRB1*1602的AF低于健康體檢組(Pc=0.013，OR=0.144)。這表明，對于廣西地區(qū)壯族女性，HLA-DRB1*0102、HLA-DQB1*0201基因是乳腺癌的易感基因，而HLA-DRB1*1602基因是其保護基因。

綜上所述，HLA-DRB1*0102、HLA-DQB1*0201可能是廣西壯族女性乳腺癌的易感基因，攜帶上述基因的廣西壯族女性患乳腺癌的風險較高，而HLA-DRB1*1602可能是廣西壯族女性乳腺癌的保護基因。但由于乳腺癌的發(fā)生與不同族群的遺傳背景關系密切，其他地區(qū)和種族的乳腺癌的易感基因型和保護基因型仍待進一步研究。