鄭育秀 劉麗麗 黃澤波 王濤 劉莉芳

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，海南 ?？?570311)

術(shù)后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)是一種神經(jīng)變性疾病，以長期POCD綜合征為特征[1]。手術(shù)和麻醉是導(dǎo)致認知障礙的主要原因，七氟醚麻醉可減少海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元存活[2]。此外，七氟醚麻醉可引起神經(jīng)毒性和POCD[3]。因此，有必要探索一種針對七氟醚麻醉誘導(dǎo)的POCD的有效神經(jīng)保護方法。越來越多的證據(jù)[4]表明，手術(shù)麻醉誘導(dǎo)的認知障礙與大腦發(fā)育相關(guān)的多種基因表達的改變有關(guān)。近年來，微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)的失調(diào)與麻醉相關(guān)的POCD有關(guān)[5]。MiRNAs是一種小的非編碼RNA，通過抑制轉(zhuǎn)錄本的翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA的降解負向調(diào)控基因表達。此外，越來越多的miRNAs已被證明與麻醉劑誘導(dǎo)的海馬細胞凋亡有關(guān)[6-7]。由于miRNAs在細胞死亡和分化的調(diào)節(jié)中具有重要作用，鑒定參與麻醉劑暴露引起認知障礙的miRNAs并了解其功能分子機制至關(guān)重要。有一項研究[8]篩選了七氟醚暴露后差異表達的miRNAs，研究表明七氟醚治療后，miR-138是顯著下調(diào)的miRNAs之一。然而miR-138在七氟醚麻醉誘導(dǎo)中的功能性分子機制仍未知。Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路參與了許多生理過程，包括炎癥、增殖、分化和發(fā)育，它可能有助于驅(qū)動神經(jīng)元對細胞因子的生存反應(yīng)[9]。此外，JAK2/STAT3是POCD發(fā)展的潛在機制。李等[10]證明Kappa阿片受體激動劑對大鼠POCD具有神經(jīng)保護作用，部分是通過抑制JAK2/STAT3通路介導(dǎo)的。在阿爾茨海默氏癥的動物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善空間學(xué)習(xí)和記憶[11]?？傊@表明miR-138可能通過JAK2/STAT3信號通路參與七氟醚麻醉誘導(dǎo)的POCD。因此，本研究通過七氟醚治療建立認知障礙大鼠模型，進一步探討miR-138在七氟醚麻醉誘導(dǎo)認知障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SD大鼠(240±10) g 90只，將其飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)條件的實驗室中[溫度(22±1)℃、濕度(60±5)%、光照/黑暗周期為12 h]。大鼠可隨意獲得水和食物。所有實驗均經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，并遵循國家衛(wèi)生研究院關(guān)于動物護理和使用的指南進行。

1.2 主要試劑及儀器 七氟醚(上海恒瑞制藥有限公司)；miR-138 mimic、NC mimic、pcDNA-LCN2腺病毒載體合成[漢恒生物科技(上海)有限公司]；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、SYBR Premix Ex Taq II、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]；ELISA試劑盒(Abcam公司)；BCA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；脂質(zhì)運載蛋白2(Lipocalin-2，LCN2)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH (Abcam公司)。Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)；多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]；顯微鏡(Leica公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及七氟醚麻醉 將SD大鼠隨機分為對照組(20只)、七氟醚組、七氟醚+NC mimic組、七氟醚+miR-138 mimic組、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組。選用70只大鼠構(gòu)建七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認知障礙大鼠模型，將大鼠置于一個以5 L/min的速率供應(yīng)2.5% 的七氟醚和空氣-氧氣混合物(吸入氧氣分數(shù)為40%)的麻醉室內(nèi)，持續(xù)吸入6 h。實驗過程中用麻醉氣體監(jiān)測儀連續(xù)監(jiān)測七氟醚和氧氣的濃度，并測量直腸溫度維持在37℃左右。其中，20只大鼠為七氟醚組，剩余50只七氟醚誘導(dǎo)的大鼠側(cè)腦室分別注射10 μL NC mimic、miR-138 mimic以及共注射miR-138 mimic+Vector和miR-138 mimic+pcDNA-LCN2腺病毒懸液，記為七氟醚+NC mimic組(20只)、七氟醚+miR-138 mimic組(20只)、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組(5只)、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組(5只)。對照組大鼠：吸入空氣-氧氣混合物6 h，共20只。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 通過實驗評估暴露于七氟醚和常規(guī)空氣中大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。每組大鼠被訓(xùn)練在圓形水池中游泳5天。水池中放置一個直徑約10 cm、距水面2 cm的隱藏圓形平臺。將大鼠從不同位置(北、南、東、西)放入水中，實驗要求大鼠在60 s內(nèi)游泳并找到平臺，當(dāng)大鼠在規(guī)定時間內(nèi)無法找到隱藏的平臺時，則將大鼠引導(dǎo)到平臺上，休息10 s再進行下一次實驗。采用ANY-maze動物行為視頻跟蹤系統(tǒng)記錄第5 d每只大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)、穿越平臺次數(shù)。

1.3.3 HE染色 HE染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元的病理變化。各組大鼠深度麻醉后，逐層解剖暴露心臟，先灌注0.9%生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛。灌注成功后解剖腦組織，固定后用石蠟包埋并切片。根據(jù)蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒說明書進行染色，蘇木精染色細胞核，伊紅染色細胞質(zhì)。最后，在顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)并拍照。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) Morris水迷宮實驗結(jié)束后，通過斷頭處死大鼠。在冰上快速解剖海馬組織，使用研缽將組織磨成粉末。分別用Trizol試劑從海馬組織中提取總RNA。使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Premix Ex Taq II檢測miR-138和LCN2的表達水平。GAPDH和U6分別用作LCN2和miR-138的內(nèi)部對照，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量?；蛞镄蛄斜?，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 Western blotting 大鼠海馬組織在含有1%苯甲磺酰氟的RIPA裂解緩沖液中勻漿。離心后收集上清液。采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離。隨后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后與一抗在4℃孵育過夜，然后與相應(yīng)的二抗在37℃孵育1 h。GAPDH作為內(nèi)參。用化學(xué)發(fā)光試劑顯現(xiàn)條帶，并在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)下觀察。利用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 將每組大鼠的冷凍海馬標(biāo)本與適量生理鹽水混合。充分勻漿后，在4℃下以8000 g的速度離心10 min。收集上清，根據(jù)試劑盒說明書使用ELISA試劑盒測定海馬組織中IL-6、TNF-α和IL-1β的表達水平。

1.3.7 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法) 使用TUNEL染色試劑盒檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。取TUNEL試劑盒中試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1：9混合，覆蓋切片。TUNEL標(biāo)記后，用4-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)作為熒光示蹤劑復(fù)染海馬神經(jīng)元以檢測細胞核。腦凋亡細胞均為TUNEL陽性，熒光顯微鏡下為綠色熒光標(biāo)記。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因 將LCN2的野生型(WT-LCN2)和突變型(MUT-LCN2)3’UTR構(gòu)建到pMIR-REPORT螢火蟲熒光素酶載體中，該載體包含miR-138的預(yù)測結(jié)合位點。將293T細胞以1000個細胞/孔的密度接種到96孔板中。然后使用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染100 nM miR-138 mimic或NC mimic。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告分析試劑盒測定熒光素酶活性，并用腎素?zé)晒馑孛富钚詷?biāo)準(zhǔn)化。實驗重復(fù)3次?；蛐蛄校簃iR-138序列為GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA；WT-LCN2序列為AUCACCUGGCUGCCCCACCAGCC；MUT-LCN2序列為AUCACCUGGCUGCCCACAAGAAC。

2 結(jié)果

2.1 miR-138在七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬中的表達水平 與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬中miR-138的表達均顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬中miR-138的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬中miR-138的表達水平

2.2 miR-138改善七氟醚誘導(dǎo)的大鼠空間認知能力 Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠逃避潛伏期均顯著增加，穿越平臺次數(shù)均顯著減少(P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠逃避潛伏期顯著減少，穿越平臺次數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 miR-138減輕七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷 HE染色結(jié)果顯示，對照組海馬組織排列規(guī)則，未見明顯的病理損傷；七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)不完整，核濃縮，排列紊亂松散，體積小；而七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬神經(jīng)元的病理損傷一定程度上得到了改善，病理損傷減輕。見圖3。

圖3 HE染色檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷(400×)

2.4 miR-138抑制七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量均顯著增加，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均顯著升高，Bcl-2顯著降低(均P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著減少，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-138抑制七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡

2.5 miR-138抑制七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng) ELISA實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著增加(均P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組中IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖5。

圖5 miR-138抑制七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元炎癥反應(yīng)

2.6 LCN2是miR-138的靶基因 雙熒光素酶報告實驗顯示，與LCN2-MUT和miR-138 mimic共轉(zhuǎn)染的細胞相比，miR-138 mimic與LCN2-MUT共轉(zhuǎn)染的細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。此外，RT-qPCR和Western blotting結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組中LCN2水平均顯著升高，而七氟醚+miR-138 mimic組LCN2水平較七氟醚組、七氟醚+NC mimic組顯著降低(均P<0.05)。見圖6。

圖6 LCN2是miR-138的靶基因

2.7 miR-138靶向LCN2對七氟醚誘導(dǎo)的海馬中JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的影響 與七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2水平升高，p- JAK2和p-STAT3蛋白水平

升高(均P<0.05)；與七氟醚+miR-138 mimic組、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組比較，七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均顯著升高，Bcl-2水平降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的表達

3 討論

POCD發(fā)病機制復(fù)雜，由麻醉和手術(shù)及多種因素引起的神經(jīng)功能衰退，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和凋亡。七氟醚是一種常用的吸入麻醉劑，引起的POCD的機制與神經(jīng)炎癥和細胞凋亡密切相關(guān)[12]。因此，深入了解七氟醚誘發(fā)POCD的機制，尋找合適的靶點和機制來減少甚至消除POCD的發(fā)生是研究的重點。

據(jù)報道，許多miRNAs與麻醉誘導(dǎo)的POCD有關(guān)。其中，在七氟醚治療后，miR-96被證明可促進海馬神經(jīng)元凋亡，加重七氟醚對海馬神經(jīng)元和認知功能的影響[13]。此外，miR-34a可促進七氟醚誘導(dǎo)的海馬細胞凋亡[14]。然而，一些miRNA對七氟醚介導(dǎo)的細胞凋亡具有神經(jīng)保護作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-665抑制七氟醚誘導(dǎo)的細胞凋亡，提示具有潛在的神經(jīng)保護作用。有研究[8]報道，miR-138是七氟醚暴露后下調(diào)最顯著的miRNA之一。本研究結(jié)果表明，與對照組大鼠相比，接受七氟醚治療的大鼠海馬組織中miR-138水平降低。

海馬體是學(xué)習(xí)、記憶以及其他基本認知能力的關(guān)鍵大腦區(qū)域[15]。因此，本實驗重點研究海馬體。七氟醚暴露可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶損傷[16]。本研究建立了七氟醚誘導(dǎo)的動物模型，通過Morris水迷宮實驗評估認知能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露在七氟醚中會導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶的缺失，表現(xiàn)為逃避潛伏期顯著增加，穿越平臺次數(shù)顯著減少；此外，七氟醚暴露導(dǎo)致海馬神經(jīng)元嚴(yán)重損傷，這與之前的報道[17]關(guān)于麻醉藥引起的認知障礙是一致的。miR-138可以減少潛伏期時間，增加穿越平臺次數(shù)，海馬神經(jīng)元的病理損傷減輕，這些結(jié)果表明miR-138可能在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的大鼠認知障礙中具有重要作用。

研究[18]表明，七氟醚麻醉引起的大腦結(jié)構(gòu)和神經(jīng)POCD的變化是由激活的caspase-3的表達變化和神經(jīng)細胞凋亡誘導(dǎo)引起的。Bcl-2家族的蛋白質(zhì)，如Bax和Bcl-2被發(fā)現(xiàn)是調(diào)節(jié)線粒體膜對細胞色素C的通透性的分子，而Caspase-9被發(fā)現(xiàn)在細胞死亡中起核心作用[19]?？沟蛲龅鞍譈cl-2在神經(jīng)退行性疾病、缺血、氧化應(yīng)激和創(chuàng)傷等多種逆境下調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，促凋亡Bax是許多神經(jīng)細胞群體中誘導(dǎo)凋亡和壞死的重要因素[20-21]。而miR-138治療則改善七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，這可以通過TUNEL染色以及凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax水平的降低以及Bcl-2蛋白水平的升高來證明，提示miR-138通過抑制中樞神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而，POCD病的發(fā)病機制非常復(fù)雜，可能包括吸入麻醉藥的直接作用、手術(shù)創(chuàng)傷的后果以及炎癥反應(yīng)。針對炎癥因子分布，有證據(jù)[22]表明，海馬中促炎癥因子和抗炎因子水平的變化與七氟醚誘導(dǎo)的POCD有關(guān)。此外，我們還證明了miR-138對炎癥的抑制作用，包括降低IL-6、TNF-α 、IL-1β的水平。雖然miRNA在七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和炎癥中發(fā)揮不同的作用，但miRNA的表達與七氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元進展密切相關(guān)。這些結(jié)果表明miR-138可以作為海馬凋亡和炎癥的抑制因子，減輕七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認知障礙。

為了進一步確定miR-138在七氟醚誘導(dǎo)的認知障礙中的作用機制，本研究證明了miR-138可以與LCN2的3′-UTR結(jié)合并負調(diào)控其水平。在其他疾病中，miR-138-5p和LCN2表現(xiàn)出與我們的結(jié)果一致的調(diào)節(jié)關(guān)系。如miR-138可以負調(diào)控LCN2的表達，從而抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[23]。LCN2是分泌型脂蛋白家族的成員，參與先天免疫、細胞凋亡和腎臟發(fā)育等多種細胞過程[24]。既往研究[25]還表明LCN2缺失會減弱海馬神經(jīng)元死亡和認知能力下降。此外，腦室內(nèi)注射重組LCN2蛋白引起CA1神經(jīng)元死亡和POCD。據(jù)報道[26]LCN2通過JAK2/STAT3通路抑制神經(jīng)炎癥損傷，在腦缺血中發(fā)揮了強大的治療作用。研究[27]發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3通路與認知功能有關(guān)，如右美托咪定通過JAK2/STAT3途徑減輕異氟醚誘導(dǎo)的認知障礙；山參處理通過激活JAK2/STAT3顯著減輕了通常由三甲基素引起的認知障礙[28]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚麻醉不僅增加了Bax的表達，降低了Bcl-2的表達，而且還增加了p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平。這些結(jié)果表明七氟醚誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)。此外，miR-138治療抑制了神經(jīng)元的凋亡，并且p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平降低，而LCN2過表達又一次逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果，表明miR-138靶向LCN2通過JAK2/STAT3通路抑制七氟醚麻醉誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，miR-138 靶向LCN2通過JAK2/STAT3信號通路對七氟醚麻醉誘導(dǎo)的大鼠POCD具有神經(jīng)保護作用，為七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認知障礙治療提供了新的靶點。然而，miR-138在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認知障礙中的分子機制要進一步闡明，仍需進一步深入研究。