段艷芳 劉風(fēng)偉 秦業(yè)強(qiáng) 趙金梅 何文慧 姚曉玲

(滄州市人民醫(yī)院產(chǎn)科，河北 滄州 061000)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是女性妊娠期常見的內(nèi)科合并癥之一，GDM常造成子代肺發(fā)育障礙，導(dǎo)致新生兒存活率降低[1]。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞通過啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程使肺泡上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞表型，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型，從而發(fā)生肺纖維化，出現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病和哮喘等[2-3]。二甲雙胍(Metformin，Met)是常用的降糖藥，臨床研究表明，Met可安全有效的控制GDM患者血糖水平，改善母嬰結(jié)局[4]。此外，Met可降低新生兒窘迫、高膽紅素血癥和巨大兒等發(fā)生率，有效改善GDM患者妊娠結(jié)局[5]。研究表明，Met可抑制TGF-β1或博來霉素誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT[6]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription faction kappa B，NF-κB)/Twist1信號通路與EMT過程密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，白楊素通過阻斷NF-κB/Twist1信號通路逆轉(zhuǎn)宮頸癌EMT過程，發(fā)揮抗癌作用[7]。白楊素通過調(diào)控NF-κB/Twist 1信號通路抑制博來霉素誘導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT[8]。本研究探討Met對GDM大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠15只，8周齡，體重200～220 g；雌鼠30只，8周齡，體重180～200 g；購自北京天誠醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(京)2016-0047。本研究經(jīng)過我院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑和儀器 Met和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司；波形蛋白(Vimentin)、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)和神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin，N-cad)PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；NF-κB、p-NF-κB和Twist1蛋白抗體購自美國Abcam公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；電泳儀購自北京六一電子儀器公司；多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。

1.3 模型制備[9-10]將30只雌鼠隨機(jī)分為正常組(Normal組，10只)和GDM(20只)組，正常組雌鼠用普通飼料喂養(yǎng)，GDM組雌鼠用高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)4周后，將雌雄鼠按2∶1比例合籠，次日清晨進(jìn)行陰道涂片，若發(fā)現(xiàn)精子則記為妊娠第0天，所有大鼠均受孕成功。GDM組受孕雌鼠腹腔注射1% STZ 30 mg/kg(溶于pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用)，正常組受孕雌鼠腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，3 d后，尾靜脈采血檢測雌鼠空腹血糖(FBG)水平(采血前禁食不禁水12 h)，F(xiàn)BG≥16.67 mmol/L視為GDM模型制備成功，其余鼠剔除，共造模成功18只。孕期GDM組雌鼠仍用高脂飼料喂養(yǎng)，17 d后所有雌鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈采血測定雌鼠FBG。將孕19 d的雌鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，消毒后剖腹取出胎鼠，超凈工作臺中迅速取出胎鼠肺組織，預(yù)冷PBS進(jìn)行清洗，剪成體積為1 mm3的組織塊，胰蛋白酶消化20 min，1200 r/min離心5 min，棄掉上清，0.1% Ⅳ型膠原酶消化15 min，篩網(wǎng)過濾，1200 r/min離心5 min棄上清，含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將沉淀懸浮，將懸浮液接種于包被大鼠IgG的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，吸出未貼壁細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，重復(fù)上述操作3次。吸取未貼壁細(xì)胞，1200 r/min離心5 min，棄上清，用含20% 胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的GDM組細(xì)胞，制成濃度為2×105/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別加入濃度為0、20、40、60、80和100 μmol/L的Met處理48 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，之后每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振蕩，10 min后置于490 nm波長處測定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(給藥組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞存活率接近50%的Met濃度(80 μmol/L)。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測侵襲細(xì)胞數(shù) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成濃度為2×105/mL的單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，隨機(jī)分為對照組(Control組)、GDM組和Met組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。Met組細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞存活率選擇用80 μmol/L Met處理48 h，GDM組和Control組細(xì)胞不做處理。Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋，Transwell小室上室每個(gè)微孔表面鋪以40 μL稀釋后的Matrigel膠，置于培養(yǎng)箱中4 h。每個(gè)上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出小室，清洗3次，濕棉簽拭去上室中的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，預(yù)冷PBS清洗3次，顯微鏡下觀察并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6 qRT-PCR法檢測細(xì)胞中各蛋白mRNA相對表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)分組和處理方法同1.5。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，測定RNA純度和濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)分組和處理方法同1.5。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，裂解、離心、取上清，BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性。上樣，120 V電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗膜3次，室溫封閉1 h，4℃條件下p-NF-κB、NF-κB、Twist1和GAPDH抗體(1∶1000)孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 雌鼠FBG檢測結(jié)果 Normal組雌鼠FBG(5.24±1.06) mmol/L，GDM組雌鼠FBG(22.47±2.80) mmol/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.602,P<0.001)。

2.2 不同濃度Met對細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞存活率隨Met濃度的增加而降低，且具有劑量依賴性。見表2。

表2 不同濃度Met對細(xì)胞存活率的影響

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Contorl組比較，GDM組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與GDM組比較，Met組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.4 各蛋白mRNA相對表達(dá)量檢測結(jié)果 E-cad、Vimentin和N-cad mRNA相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Contorl組比較，GDM組Vimentin和N-cad mRNA相對表達(dá)量升高，E-cad mRNA相對表達(dá)量降低(P<0.05)；與GDM組比較，Met組Vimentin和N-cad mRNA相對表達(dá)量降低，E-cad mRNA相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞中E-cad、Vimentin和N-cad mRNA相對表達(dá)量比較

2.5 蛋白印跡法檢測結(jié)果 p-NF-κB p65和Twist1蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Contorl組比較，GDM組p-NF-κB p65和Twist1蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與GDM組比較，Met組p-NF-κB p65和Twist1蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)。各組間NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、圖2。

表5 各組細(xì)胞中p-NF-κB p65和Twist1蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 細(xì)胞中蛋白表達(dá)Western blot圖

3 討論

GDM被定義為妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)不同程度的糖耐量異常，常導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)或胎兒生長發(fā)育不全等嚴(yán)重后果，例如子代糖脂代謝紊亂和胰島功能障礙，或子代易發(fā)生心肌缺血再灌注損傷[11-12]。GDM對子代有多種不良影響，如糖脂代謝異常、記憶和情緒障礙等[13-14]，此外，還導(dǎo)致胎鼠肺臟發(fā)育遲緩[15]，EMT發(fā)生于糖尿病多種并發(fā)癥中，LncRNA SNHG11抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞EMT過程，可降低細(xì)胞增殖和遷移能力[16]。高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)糖尿病腎臟纖維化。Met是臨床上常用的降糖藥，此外，Met通過逆轉(zhuǎn)EMT過程發(fā)揮抗癌作用已被廣泛報(bào)道，例如肺癌和黑色素瘤等[17-18]。此外，二甲雙胍通過提高糖尿病腎病早期自噬水平可降低腎小管間質(zhì)纖維化[19]?；谝陨涎芯?，本實(shí)驗(yàn)通過建立GDM大鼠模型，分離胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，探討Met對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT過程的影響及其機(jī)制。

本研究通過測定GDM大鼠FBG水平，確定模型制備成功。不同濃度Met處理肺泡上皮細(xì)胞，細(xì)胞存活率降低，且具有濃度依賴性。E-cad、N-cad以及Vimentin是發(fā)生EMT的標(biāo)志性蛋白，E-cad屬于細(xì)胞黏附分子鈣粘蛋白家族中的主要成員，在維持細(xì)胞間黏附性、細(xì)胞極性以及細(xì)胞間信息傳遞等方面發(fā)揮重要作用，它可通過促進(jìn)細(xì)胞間連接，維持細(xì)胞骨架和連接支架穩(wěn)定，是重要的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，E-cad表達(dá)下調(diào)標(biāo)志著EMT的發(fā)生[20]。Vimentin是中間絲蛋白家族的重要成員，在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，對維持間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、抵御外界損傷具有重要作用[21]。N-cad在胚胎發(fā)育過程中高度表達(dá)，而在成熟哺乳動物中表達(dá)非常局限，N-cad和E-cad的表達(dá)往往成反向關(guān)系，因此，N-cad的表達(dá)與EMT的發(fā)生同樣存在密切聯(lián)系[22]。本研究結(jié)果顯示：GDM組胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中E-cad mRNA表達(dá)降低，而N-cad和Vimentin mRNA表達(dá)升高，Met發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果提示：Met可逆轉(zhuǎn)GDM胎鼠肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。

Twist1是一種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，在胚胎發(fā)育以及EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，激活Twist1可降低E-cad，同時(shí)升高N-cad和Vimentin[25]。Twist1激活受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，其中由炎癥因子誘導(dǎo)活化的NF-κB即是其中之一[26]。Wu等[27]研究發(fā)現(xiàn)COL11A1通過激活NF-κB/Twist1信號軸增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞化療耐藥性，抑制細(xì)胞凋亡。Tu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB/Twist1信號通路參與人乳頭狀甲狀腺癌EMT過程。因此，本研究采用蛋白印跡法檢測NF-κB/Twist1信號通路在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：GDM組細(xì)胞中p-NF-κB p65和Twist1蛋白相對表達(dá)量升高，而Met組二者表達(dá)降低，結(jié)果表明Met可抑制NF-κB/Twist1信號通路。

4 結(jié)論

Met可抑制GDM大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT過程，其可能是通過抑制NF-κB/Twist1信號通路發(fā)揮作用，為臨床治療GDM子代肺損傷提供理論依據(jù)。