加爾寶·吐爾德 阿迪娜·賈庫(kù)林 聞淑娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.淋巴瘤內(nèi)科;2.乳腺放療科，新疆 烏魯木齊 830011)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種高度侵襲性和異質(zhì)性的腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤最常見的形式[1-2]。隨著新型靶向治療的發(fā)展，大部分DLBCL患者可以治愈[3]。然而，仍有40%～50%的DLBCL患者表現(xiàn)為難治性或復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，最終死于疾病進(jìn)展[4-5]。因此，DLBCL的治療還需要探尋更多的治療手段。

靶向CD19的嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)難治性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[6]。然而，免疫抑制微環(huán)境的存在顯著削弱了CAR-T細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的療效[7-8]。前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，PD-L1在DLBCL中顯著高表達(dá), 是此類患者不良預(yù)后因素。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)是一種有效的增強(qiáng)B細(xì)胞淋巴瘤免疫應(yīng)答的手段[11]。此外，研究[12-13]顯示，包含ICOS胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)功能和體內(nèi)持久性。

在本研究中，為了逆轉(zhuǎn)PD-1/PD-L1信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)基于ICOS胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以增強(qiáng)T細(xì)胞的效應(yīng)功能和體內(nèi)持久性的特點(diǎn)，我們將PD-1受體的胞外結(jié)構(gòu)域與ICOS受體的胞內(nèi)信號(hào)域融合，并將這種嵌合受體共表達(dá)在CD19-CAR-T細(xì)胞中，來探索這種新型CAR-T細(xì)胞對(duì)DLBCL的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血液樣本 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞DB購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI-1640+10%胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5% CO2條件下。過表達(dá)luciferase的DB細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建保存。Ficol試劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3/CD28磁珠購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；IL-2購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；Polybrene購(gòu)自美國(guó)sigma公司；CFSE試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；熒光素酶底物購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司；FITC標(biāo)記的CD19蛋白購(gòu)自北京Acro公司；PE標(biāo)記的抗Myc抗體，PE標(biāo)記的抗CD69抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；FITC標(biāo)記的抗CD3抗體，PE標(biāo)記的抗CD4抗體，APC標(biāo)記的抗CD8抗體購(gòu)自北京義翹神州有限公司；過表達(dá)CD19-CAR以及過表達(dá)PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司。15只5周齡大小的雌性NCG小鼠(體重在23 g左右)購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)，小鼠飼養(yǎng)SPF屏障環(huán)境中，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。志愿者招募自我院體檢中心3例健康體檢者，其中男2例，女1例，平均年齡45歲(年齡范圍40～49歲)，平均BMI為37.6 kg/m2(BMI范圍為35.5～38.2 kg/m2)，每位志愿者抽取20 mL的外周血，抽血程序經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者簽署知情同意書。

1.2 慢病毒感染法構(gòu)建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 按照制造商的說明，使用Ficol試劑從外周血中分離外周血單核細(xì)胞，然后按3∶1的磁珠與細(xì)胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室溫孵育30 min，之后將磁珠細(xì)胞混合物放入專用磁力架中靜置5 min，連同磁力架一起傾倒管中的液體，之后用完全培養(yǎng)基將試管中的磁珠細(xì)胞混合物按1×106/mL重懸，培養(yǎng)48 h后，按MOI值為10分別加入過表達(dá)CD19-CAR以及過表達(dá)PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒，并額外添加6 μg/mL的polybrene，在水平離心機(jī)中按800 g離心90 min，之后放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，并在感染72 h后使用流式檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的陽性率。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)bbz以及PD-1/ICOS-bbz的陽性率 分別取3×105個(gè)未感染的T細(xì)胞(Mock)，bbz以及PD-1/ICOS-bbz，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重懸，之后加入5 μL PE標(biāo)記的抗Myc抗體以及FITC標(biāo)記的CD19蛋白，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果使用Flowjo V10進(jìn)行處理。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)期共孵育后T細(xì)胞中CD69的表達(dá)情況 分別取2×106個(gè)bbz以及PD-1/ICOS-bbz，按照試劑盒的說明用CFSE染料進(jìn)行標(biāo)記，之后按照效靶比為2∶1與DB細(xì)胞共孵育，每隔7 d加入新鮮的DB細(xì)胞，共添加3次，在共孵育35 d后，取20 μL細(xì)胞懸液，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重懸，之后加入5 μL PE標(biāo)記的抗CD69抗體，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果使用Flowjo V10進(jìn)行處理。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)期共孵育后T細(xì)胞的增殖情況 按照1.4的共孵育方法，每隔7 d取50 μL細(xì)胞懸液，利用T細(xì)胞標(biāo)記CFSE的特性，使用流式細(xì)胞儀對(duì)CFSE+的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以此來統(tǒng)計(jì)T細(xì)胞的增殖情況。

1.6 LDH釋放法檢測(cè)bbz以及PD-1/ICOS-bbz對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性 按照1.4的共孵育方法，在共孵育結(jié)束后，取2×106個(gè)細(xì)胞混合物，按照3∶1的磁珠與細(xì)胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室溫孵育30 min，之后將磁珠細(xì)胞混合物放入專用磁力架中靜置5 min，連同磁力架一起傾倒管中的液體，得到T細(xì)胞。再按照效靶比為2∶1與DB細(xì)胞共孵育24 h，期間不添加任何細(xì)胞因子，之后按照制造商的說明使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。計(jì)算公式為：細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度) / (細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100。

1.7 體內(nèi)移植瘤模型檢測(cè)PD-1/ICOS-bbz的體內(nèi)抗腫瘤活性 取5×106個(gè)DB-luciferase細(xì)胞，重懸于200 μL PBS中，通過尾靜脈回輸至NCG小鼠體內(nèi)，接種7 d后，所有小鼠均成功長(zhǎng)出腫瘤，將15只小鼠分為3組(Mock組，bbz組及PD-1/ICOS-bbz組，每組5只小鼠)，通過尾靜脈分別回輸1×107個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，在接種腫瘤細(xì)胞后第14 d腹腔注射1 mg/kg的luciferase底物，并通過活體成像儀對(duì)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行成像。之后密切監(jiān)控小鼠的死亡情況。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中T細(xì)胞的比例 通過眼眶采血取50 μL小鼠外周血，使用350 μL紅細(xì)胞裂解液室溫裂解3 min，之后加入1 mL PBS混勻，清洗3次后，加入FITC標(biāo)記的抗CD3抗體，PE標(biāo)記的抗CD4抗體，APC標(biāo)記的抗CD8抗體，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果使用Flowjo V10進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染法構(gòu)建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)bbz及PD-1/ICOS-bbz的陽性率，結(jié)果顯示，bbz和PD-1/ICOS-bbz中CD19-CAR的陽性率分別為31.1%和36.3%(見圖1A)，而只有PD-1/ICOS-bbz中表達(dá)PD-1/ICOS嵌合受體，陽性率為42.2%，見圖1B。

圖1 bbz和PD-1/ICOS-bbz的表征

2.2 長(zhǎng)期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的激活水平更高 在經(jīng)過35 d的體外共孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面激活marker的表達(dá)情況，結(jié)果表明，PD-1/ICOS-bbz較bbz CD69的表達(dá)水平顯著提高(P<0.001),見圖2。

圖2 長(zhǎng)期共孵育后bbz和PD-1/ICOS-bbz的激活

2.3 長(zhǎng)期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的增殖能力和細(xì)胞毒性水平更高 細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，在長(zhǎng)期共孵育過程中PD-1/ICOS-bbz較bbz增殖能力顯著提高(P<0.01)(見圖3A)。此外，共孵育結(jié)束后取T細(xì)胞與DB細(xì)胞共孵育，結(jié)果表明，PD-1/ICOS-bbz較bbz對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性更高(P<0.01),見圖3B。

圖3 bbz和PD-1/ICOS-bbz長(zhǎng)期共孵育后的增殖和細(xì)胞毒性

2.4 PD-1/ICOS-bbz顯著清除小鼠體內(nèi)的淋巴瘤細(xì)胞 使用小鼠移植瘤模型評(píng)估PD-1/ICOS-bbz體內(nèi)抗腫瘤活性，活體成像結(jié)果顯示，在第14 d時(shí)PD-1/ICOS-bbz治療組體內(nèi)腫瘤被完全清除，而bbz組仍有存活部分腫瘤細(xì)胞(見圖4A)。生存結(jié)果顯示，bbz治療組的小鼠在43 d時(shí)已全部死亡，而PD-1/ICOS-bbz治療組的小鼠在70 d時(shí)仍全部存活(P<0.01),見圖4B。

圖4 bbz和PD-1/ICOS-bbz對(duì)DB細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性

2.5 PD-1/ICOS-bbz具有更強(qiáng)的體內(nèi)增殖能力 流式結(jié)果顯示，PD-1/ICOS-bbz治療組中外周血CD3+T細(xì)胞的數(shù)目較bbz組顯著增多(見圖5A)，且PD-1/ICOS-bbz治療組的T細(xì)胞具有更多的CD8+T細(xì)胞的比例，表明其腫瘤殺傷能力更強(qiáng)，見圖5B。

圖5 bbz和PD-1/ICOS-bbz在體內(nèi)的增殖

3 討論

CAR-T細(xì)胞被認(rèn)為是一種有效的B細(xì)胞淋巴瘤的治療手段[14]。然而，現(xiàn)存的CAR-T細(xì)胞對(duì)復(fù)發(fā)/難治性DLBCL患者的療效有限，客觀緩解率只能維持在60%左右[15-16]。為了進(jìn)一步提高CAR-T細(xì)胞對(duì)DLBCL療效，降低腫瘤微環(huán)境的影響，我們構(gòu)建了共表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)換受體的增強(qiáng)型CAR-T細(xì)胞。結(jié)果表明，含有PD-1/ICOS信號(hào)轉(zhuǎn)換受體的CD19-CAR-T細(xì)胞能夠特異性清除表達(dá)CD19的DLBCL，有效延長(zhǎng)小鼠的生存期。此外，與二代的CD19-CAR-T細(xì)胞相比，含有PD-1/ICOS信號(hào)轉(zhuǎn)換受體的CD19-CAR-T細(xì)胞具有顯著的增殖優(yōu)勢(shì)，這種特性使PD-1/ICOS-bbz具有更強(qiáng)的臨床應(yīng)用潛力，因?yàn)榈侥壳盀橹?，大部分?bào)道的經(jīng)CAR-T細(xì)胞治療失敗的DLBCL患者，其外周血CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增都令人失望[17]。既往研究[18]報(bào)道，長(zhǎng)期慢性刺激CAR-T細(xì)胞可導(dǎo)致其衰竭。而在本研究中，體外結(jié)果顯示，在經(jīng)過長(zhǎng)期刺激后，PD-1/ICOS-bbz較bbz仍具有更好的腫瘤殺傷活性。

通過回輸CAR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用，然而大多數(shù)腫瘤會(huì)采取多種策略來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。這種逃逸策略大致可以分為兩類，一種是防止T細(xì)胞識(shí)別的策略，如目標(biāo)抗原和主要組織相容性復(fù)合體表達(dá)下調(diào)[19-20]；還有就是通過限制T細(xì)胞持久性和效應(yīng)功能的策略，如抑制配體/受體(如CTLA-4、PD-1和LAG-3)的表達(dá)[21-22]。研究人員已經(jīng)通過設(shè)計(jì)抑制配體阻斷劑，證明可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[23]。但系統(tǒng)性施用這類藥物往往會(huì)引起較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)[24]。本研究設(shè)計(jì)的PD-1/ICOS信號(hào)轉(zhuǎn)換受體使得回輸?shù)腃AR-T細(xì)胞在腫瘤局部解除PD-1/PD-L1的抑制作用，有效減小全身的副反應(yīng)。

先前的研究表明，ICOS共刺激受體被證明可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性[25]。此外，基于ICOS作為共刺激信號(hào)的CAR受體增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放和體內(nèi)持久性[26]。本研究設(shè)計(jì)的PD-1/ICOS信號(hào)轉(zhuǎn)換受體將腫瘤微環(huán)境中的PD-1信號(hào)轉(zhuǎn)換為ICOS信號(hào)，證明的確可以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的增殖活性。

CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療時(shí)應(yīng)該平衡療效和毒性。然而，由于缺乏良好的動(dòng)物模型，限制了對(duì)PD-1/ICOS-bbz毒性的評(píng)價(jià)[27]。盡管如此，我們可以在后續(xù)的研究中為PD-1/ICOS-bbz額外設(shè)計(jì)一些安全開關(guān)，使其即使發(fā)生不良反應(yīng)，也可以及時(shí)采取相應(yīng)手段予以控制[28]。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了通過逆轉(zhuǎn)腫瘤來源的抑制信號(hào)來增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性的可行性。嵌合受體(PD-1/ICOS)與腫瘤細(xì)胞上的PD-L1結(jié)合，并激活I(lǐng)COS受體相關(guān)的下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的增殖能力及體內(nèi)的抗腫瘤活性。該研究為DLBCL的治療提供了一種潛在的方案，有望在不遠(yuǎn)的未來進(jìn)行臨床研究進(jìn)一步探索其治療效果。