吳瓊 張振武 王哲銀 張娟 趙妍

(深圳市人民醫(yī)院疼痛科，廣東 深圳 518020)

胰腺癌是癌癥死亡的重要原因之一，大多數(shù)胰腺癌患者在診斷時出現(xiàn)中度至重度疼痛，故疼痛治療尤為重要。胰腺癌疼痛的原因包括神經(jīng)鞘和神經(jīng)節(jié)的浸潤、導管和間質(zhì)壓力增加以及腺體炎癥[1-2]。但胰腺癌疼痛機制尚未完全了解，目前對癌癥疼痛的評估和治療策略尚不充分。T細胞死亡相關基因8(TDAG8)是OGR1家族的一員，被鑒定為一種質(zhì)子感應G蛋白偶聯(lián)受體。TDAG8主要在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元中表達。越來越多的研究[3]表明TDAG8在疼痛中具有重要作用，如減弱脊髓中TDAG8的表達可抑制骨癌疼痛。另外，TDAG8可以調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量來控制類風濕性關節(jié)炎慢性疼痛[4]。然而，目前對TDAG8維持胰腺癌疼痛的功能作用和潛在機制知之甚少。有研究[5-6]表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的激活可導致各種刺激引起的疼痛相關行為，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)損傷。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是AKT下游信號分子，調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯起始、核糖體生物合成和凋亡。最近的證據(jù)表明mTOR在脊髓和感覺神經(jīng)元軸突中表達，阻斷mTOR可減輕與局部炎癥或神經(jīng)性疼痛相關的疼痛相關行為[7-8]。然而，AKT/mTOR在胰腺癌疼痛中的作用報道鮮少。因此，本研究構建裸鼠移植瘤胰腺癌疼痛模型，通過沉默TDAG8及AKT通路抑制劑LY294002處理模型鼠來探討TDAG8在胰腺癌疼痛中的作用，進一步為臨床試驗提供可能幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑、儀器 人胰腺癌細胞系SW1990細胞(中國科學院ATCC細胞庫)； AKT/mTOR通路抑制劑LY294002(上海碧云天生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司)；NC-siRNA、TDAG8-siRNA (siRNA鏈經(jīng)過化學修飾)(深圳華大基因)； Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；TDAG8、降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗體(英國Abcam公司)。電子Von Frey測痛儀(美國IITC)；石蠟切片機(德國Leica公司)；普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BioRad公司)。

1.1.2 實驗動物 5周齡雌性BALB/c裸鼠(19～21 g)48只飼養(yǎng)在溫度23℃～25℃、濕度45%～55%的12 h的光/暗循環(huán)環(huán)境中，食物和水可以隨意獲得。所有實驗得到本院倫理委員會的批準(IACUC202006)。

1.2 方法

1.2.1 構建胰腺癌裸鼠模型 人胰腺癌細胞系SW1990保存在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基。BALB/c裸鼠在特定的無病原體環(huán)境中適應一周后，用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉裸鼠，在左側(cè)腰區(qū)切開腹部，將胰腺尾部和脾臟暴露出來。用裝有26號針的注射器將20 μL SW 1990細胞(5×106)緩慢注入胰腺體內(nèi)，形成2～3 mm的囊泡。隨后將胰腺和脾臟移入腹腔，用手術縫合線縫合切口。所有手術均在超凈臺中進行。然后，進行藥物治療和疼痛行為。

1.2.2 實驗分組及給藥 將裸鼠隨機分為4組：假手術組(Sham組)、模型組(Model組)、NC-siRNA組、TDAG8-siRNA組，每組12只。Sham組裸鼠注射相同體積的培養(yǎng)基作為對照。NC-siRNA、TDAG8-siRNA、LY294002組在構建胰腺癌裸鼠模型后分別每天腹腔注射100 μL NC-siRNA、TDAG8-siRNA。同時模型組裸鼠隨機分兩組，分別腹腔注射AKT/mTOR通路抑制劑LY294002 30 mg/kg (LY294002組)以及相同體積的DMSO溶液(DMSO組)作為對照。

1.2.3 HE染色 裸鼠造模4周后，將Sham組和Model組裸鼠麻醉，隨后解剖裸鼠胸腔暴露心臟，生理鹽水灌注主動脈，然后用4%多聚甲醛固定。灌注成功后，將胰腺從腹膜臟器分離，置于4%多聚甲醛過夜。將胰腺組織放入不同酒精梯度脫水，二甲苯透明，隨后制作石蠟組織塊，并切成5 μm的切片。切片經(jīng)二甲苯和酒精梯度脫蠟、復水。然后根據(jù)HE試劑盒說明書進行染色，染色完成后梯度酒精脫水，晾干，用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織切片，拍照保存。

1.2.4 測量體重 分別于造模后1、3、5、7、10、14、21、28 d測量Sham組和Model組裸鼠體重，記錄并分析。

1.2.5 駝背評分 將裸鼠單獨放置在一個開闊的場地中心，地板上覆蓋著干凈的無紡布，并對其進行300秒的觀察。駝背行為0～4分：0分：正常；1分：輕度聳起；2分：嚴重聳起；3分：嚴重駝背，活動減少；4分：靜止不動。觀察人員對組別進行盲法，由3名獨立人員統(tǒng)計結果。

1.2.6 檢測裸鼠腹部機械性痛覺閾值 為了評估裸鼠機械痛覺過敏行為，實驗動物提前3 d在試驗環(huán)境中適應，每天10 min。根據(jù)以前報道的方法[10]，采用電子Von Frey儀測量機械痛閾值。將裸鼠置于網(wǎng)狀篩網(wǎng)平臺頂部的塑料室中，適應10 min。逐漸以越來越大的力刺激裸鼠上腹部區(qū)域的皮膚。在刺激過程中的裸鼠出現(xiàn)舔撓腹部或者退縮被認為是陽性反應。記錄儀器獲得的值為機械痛閾值。試驗連續(xù)進行5次，計算平均痛閾值(每15 min 進行一次試驗)。

1.2.7 實時熒光定量PCR 在手術后的不同時間點處死裸鼠，由于胰腺由來自脊髓T8～12的神經(jīng)支配，因此使用Trizol試劑從脊髓背角組織中提取總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)分析，并使用β-actin標準化靶基因mRNA的相對表達。引物序列：TDAG8：forward 5′-CAG CAG CAC GGC CTT CCT CAC TT-3′，reverse 5′-CGA CAC TTG TTT CGT CTT CCC AC-3′；β-actin：forward 5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，reverse 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。

1.2.8 Western blotting 在手術后的不同時間點處死裸鼠，在冰上取脊髓背角組織于含有10 mM PMSF的RIPA裂解緩沖液中勻漿提取。首先，在10% SDS-PAGE凝膠上分離每孔含20 μg總蛋白的20 μL上樣緩沖液，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶在TBST中室溫封閉1 h，并與一抗在4℃下孵育過夜。二抗孵育2 h后，使用Bio-Rad紫外成像系統(tǒng)檢測印跡信號，Image J軟件對免疫印跡進行定量。

2 結果

2.1 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠體重變化的比較 Sham組裸鼠術后第8 d開始體重逐漸增加，而Model組裸鼠體重從第8 d逐漸降低，與Sham組比較，Model組裸鼠第10～28 d體重顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組裸鼠的體重變化

2.2 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠胰腺組織病理學變化的比較 HE染色結果顯示，Sham組裸鼠胰腺組織中腺泡細胞排列整齊，并且觀察到規(guī)則的胰島細胞；Model組裸鼠胰腺中觀察到胰腺癌細胞呈條索狀排列密集，可見炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組裸鼠的胰腺組織HE染色

2.3 胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達 為了揭示疼痛過程的分子機制，通過RT-qPCR和Western blotting 檢測胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達，結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組中TDAG8 mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組的TDAG8 mRNA和蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達

2.4 抑制TDAG8對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響 與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組裸鼠從第14～28 d駝背評分顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組裸鼠第14～28 d評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。使用Von Frey纖維測痛儀測量裸鼠腹部機械刺激痛敏反應，結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組裸鼠在術后第10～28 d腹腔機械痛閾值均顯著下降(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組裸鼠第10～28 d腹腔機械痛閾值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的表達

2.5 抑制TDAG8對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響 Western blotting 結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組的SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組裸鼠脊髓背角組織SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白的表達

2.6 LY294002對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響 與DMSO組比較，LY294002組裸鼠第14～28 d駝背評分顯著降低，并且逐漸減少(P<0.05)；裸鼠腹部機械刺激痛敏反應實驗結果顯示，裸鼠術后第10～28 d腹腔機械痛閾值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 LY294002對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響

2.7 LY294002對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響 Western blotting 結果顯示，與DMSO組比較，LY294002組SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 LY294002對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響

3 結論

胰腺癌引起的劇烈疼痛嚴重損害了患者的生活質(zhì)量，威脅患者的生命。疼痛治療的藥物包括阿片類藥物和非阿片類輔助鎮(zhèn)痛藥物，如非甾體抗炎藥物。然而，大多數(shù)疼痛治療不能控制胰腺癌疼痛[9-10]。為了研究人類胰腺癌相關疼痛，本研究通過將人SW 1990細胞移植到BALB/c裸鼠體內(nèi)，成功地建立了胰腺癌誘導疼痛裸鼠模型，這一模型與韓等[11]之前報道的模型一致。在術后第4周，組織學分析顯示，正常裸鼠內(nèi)分泌細胞排列整齊，胰島正常。內(nèi)分泌細胞和胰島分布在毛細血管周圍，用于傳遞分泌的激素。相比之下，在SW 1990異種移植裸鼠胰腺中發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織結構被破壞，表明成功構建了胰腺癌痛動物模型。本研究結果顯示SW 1990異種移植裸鼠體重明顯減輕。癌癥患者體重下降是由于疼痛和胃出口梗阻引起的，導致飲食攝入減少。

胰腺癌患者的疼痛很難控制，因為只有當腫瘤高度進展并迅速轉(zhuǎn)移到其他器官時，內(nèi)臟疼痛才會出現(xiàn)[12]。內(nèi)臟疼痛導致腹部皮膚機械刺激后疼痛閾值降低，稱為機械異常性疼痛[13]。在本研究的動物模型中觀察到類似的現(xiàn)象。SW 1990異種移植裸鼠腹部皮膚的機械閾值持續(xù)降低，表明在當前模型中，胰腺癌引起的內(nèi)臟疼痛因腫瘤進展增加而加重。內(nèi)臟疼痛引起的轉(zhuǎn)導途徑和感知與皮膚疼痛不同。腹部器官接受雙重外源性神經(jīng)支配，包括脊髓和迷走神經(jīng)。軀體性疼痛的定位和特征明確，而內(nèi)臟性疼痛則呈彌漫性定位不準確。在患者和動物模型中觀察到自發(fā)的內(nèi)臟痛行為[14-15]。在本研究中，胰腺癌誘發(fā)疼痛裸鼠模型引起顯著的駝背行為。降鈣素基因相關肽(CGRP)和P物質(zhì)(SP)是影響疼痛傳遞的兩種重要神經(jīng)遞質(zhì)，在脊髓損傷大鼠背角中表達上調(diào)。有研究[16]表明，P物質(zhì)和CGRP等神經(jīng)肽在疼痛產(chǎn)生中起關鍵作用，抑制CGRP和SP可減輕疼痛。本研究結果顯示胰腺癌誘發(fā)疼痛裸鼠中CGRP和SP表達升高，與之前研究一致。有研究[17]報道TDAG8在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中表達，支持了TDAG8參與痛覺的可能。近年研究[18-19]發(fā)現(xiàn)TDAG8參與炎癥性疼痛和骨癌性疼痛。目前鮮少有研究報道TDAG8在胰腺癌疼痛中的表達。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8表達顯著升高。此外，TDAG8基因沉默減輕了胰腺癌誘導的機械痛覺過敏和內(nèi)臟痛引起的駝背評分，并且抑制CGRP和SP的表達，以上結果證實了TDAG8在胰腺癌疼痛中具有重要作用。

AKT-mTOR信號級聯(lián)參與了一些生理和病理過程，如嗎啡耐受、痛覺過敏、血管生成等。既往研究[20]表明，AKT信號通路是神經(jīng)性疼痛脊髓中樞致敏所必需的。mTOR是AKT通路的下游激酶之一，在疼痛相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被激活，并作為阿片類藥物誘導痛覺過敏的有效靶點[21]。AKT/mTOR信號通路與疼痛密切相關外，研究表明，在慢性收縮損傷大鼠模型中，AKT/mTOR通路與慢性神經(jīng)性疼痛相關[22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)胰腺癌誘發(fā)疼痛裸鼠中AKT/mTOR信號通路相關蛋白磷酸化水平升高，這表明AKT/mTOR信號通路在裸鼠胰腺癌誘發(fā)疼痛中被激活。此外，結果還發(fā)現(xiàn)TDAG8 siRNA抑制 AKT/mTOR信號通路的激活。LY294002是一種AKT抑制劑，已被廣泛用于阻斷動物模型中的AKT/mTOR信號通路[23]。為了進一步驗證抑制AKT/mTOR信號通路在裸鼠胰腺癌誘發(fā)疼痛中的作用，本研究將LY294002腹腔注射到胰腺癌模型裸鼠體內(nèi)，同時注射等體積的DMSO為對照，隨后研究其對機械痛覺過敏及內(nèi)臟痛行為的影響。結果發(fā)現(xiàn)LY294002對胰腺癌痛裸鼠的影響結果與抑制TDAG8表達的結果一致。因此，靶向AKT/mTOR信號通路可能提供了一種通過TDAG8治療胰腺癌疼痛的策略。

4 結論

本研究結果提示，TDAG8在胰腺癌疼痛進展中具有重要作用，抑制TDAG8可通過抑制AKT/ mTOR信號通路的激活從而減輕胰腺癌疼痛。靶向TDAG8或其下游信號分子可能有效緩解胰腺癌疼痛，這一研究發(fā)現(xiàn)可能在將來為預防、減輕或完全緩解胰腺癌的疼痛治療方法提供一種新途徑。