吳勝斌 曹振東 王應(yīng)燈 王蕾 蕢綱

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 1.腎臟內(nèi)科;2.中醫(yī)科，上海 200011)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見并發(fā)癥之一，數(shù)據(jù)[1]顯示，我國糖尿病患者35%以上會發(fā)展為糖尿病腎病。目前，臨床上一般采用控制飲食、生活方式及降糖藥物等控制患者血糖，以此延緩發(fā)展為DN的速度，但并不能從實質(zhì)上對糖尿病腎病進行治療[2]。糖尿病患者發(fā)展為損傷的機制較為復(fù)雜，目前學(xué)者們一致認為主要因素為高糖、高血壓導(dǎo)致的代謝異常和血流動力學(xué)改變[3]。腎小球系膜細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)聚集等是DN早期重要的病理表現(xiàn)，其中腎小球系膜細胞和DN的發(fā)展密切相關(guān)[4]。近年來研究[5]發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細胞會因多種不同因素刺激而造成損傷，例如高糖、超氧化物、炎性因子、血管緊張素Ⅱ等，最終導(dǎo)致患者發(fā)展為糖尿病腎病。因此以人腎小球系膜細胞(Human mesangial cells，HMC)為研究對象，尋找合適的藥物修復(fù)其在特殊情況下導(dǎo)致的損傷具有重要的科研意義。人參皂苷是人參中有效活性成分之一，在抗炎、抗氧化等中發(fā)揮多種藥理作用[6-7]。有研究證實，人參皂苷Rg3可保護糖尿病大鼠的腎臟，并有效延緩纖維化的發(fā)展，在多種腎疾病中均有很好的保護作用[8]。目前DN的發(fā)病機制尚未完全闡明，有研究證實氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是DN發(fā)展中不可或缺的兩個驅(qū)動因素。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)是轉(zhuǎn)錄因子中的一種，介導(dǎo)氧化應(yīng)激通路，當(dāng)Nrf2和抗氧化物反應(yīng)元件(Antioxidant response elements，ARE)進行相互作用時，促進抗氧化蛋白、Ⅱ相解毒酶的表達，同時對體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基能有效清除，進而對細胞的氧化還原狀態(tài)進行維持；相反Nrf2的缺失會減少機體內(nèi)的抗氧化酶，加重細胞中氧化應(yīng)激的負效應(yīng)，進而對氧化應(yīng)激性纖維化疾病進行誘導(dǎo)[9-10]。本研究探討人參皂苷Rg3對高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細胞纖維化、生物活性及Nrf2/ARE信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人腎小球系膜細胞購自中國上?？茖W(xué)院。

1.1.2 試劑和儀器 人參皂苷Rg3(山東靶點藥物研究有限公司)；Nrf2、ARE多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT試劑(廣州康盛生物科技股份有限公司)；MoFlo XDP流式細胞儀(Beckman Coulter公司)；150i二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；TDZ4臺式低溫離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；電子分析天平(美國丹佛儀器公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組 常規(guī)復(fù)蘇人腎小球系膜細胞，將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，2～3 d傳代，當(dāng)細胞生長達到60%～80%融合狀態(tài)時，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將人腎小球系膜細胞分NC組(用含5.6 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞48 h)、HG組(用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3A組(用含30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3B組(用含30 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)、Rg3C組(用含30 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)HMC細胞)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長的人腎小球系膜細胞，消化后接種于96孔板內(nèi)，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中分別配于12、24、48、72 h。將新鮮配制的5 g/L MTT溶液分別加入到空版內(nèi)，棄掉上清液，將150 μL二甲基亞砜加入到各孔的細胞中，溶解甲瓚。測定酶標儀于490 nm處的吸光度值。

1.4 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將各組細胞置于24孔板內(nèi)，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，將Matrigel基質(zhì)膠稀釋1倍后均勻的鋪在Transwell小室的上室微孔膜上，于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育4 h。收集各組HMC細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105/mL，常規(guī)培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)細胞24 h。在上室中加入不含血清的饑餓培養(yǎng)細胞懸液，同時上室加入0.1%BSA，將500 μL含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入到Transwell小室的下室中，培養(yǎng)36 h，用棉簽將上室上面的非侵襲細胞及基質(zhì)膠擦拭干凈，于4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.01%伊紅染色液37℃染色30 min，懸掛晾干小室并置于載玻片上，倒置顯微鏡下隨機讀取10個高倍視野，計算穿模細胞數(shù)并取均值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期水平 取各組細胞，培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化，PBS溶液洗滌細胞并重懸，用5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μL PI于室溫環(huán)境中染色細胞，15 min后孵育細胞，用流式細胞儀檢測細胞。凋亡細胞用膜聯(lián)蛋白V表達標記，和對照組比較后計算細胞的凋亡率。將各組細胞用冰冷的70%乙醇固定，PBS重懸細胞，將RNA酶加入到細胞中，于37℃環(huán)境中孵育細胞，30 min后將細胞置于400 μL PI中，室溫培養(yǎng)細胞40 min。用流式細胞儀分析G0、G1、S、M中不同相中的細胞。

1.6 ROS水平檢測 采用熒光探針DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS水平。取各組細胞，培養(yǎng)48 h后，并懸浮于1 mL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA液中，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育。30 min后離心細胞(1000 r/min，5 min)和PBS洗滌，上流式細胞儀488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長檢驗熒光強度(FI)，間接檢測ROS含量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測細胞中Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白 Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN的表達取各組細胞，培養(yǎng)48 h后裂解，離心裂解后的細胞，收集上清液，用BCA法測定上清液中的蛋白濃度。將5×上樣緩沖液加入到細胞中，煮沸細胞至變性，保存于-80℃環(huán)境中。取5 μL蛋白樣品并電泳，待半干時轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉(5%)封閉1 h，用特異性抗體孵育膜過夜(4℃)，用對應(yīng)的二抗繼續(xù)孵育2 h。用ECL法檢測，并分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 HG組細胞增殖活性較NC組顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)；Rg3C組細胞增殖活性低于Rg3B組，Rg3B組細胞增殖活性低于Rg3A組(P<0.05)。見圖1。

圖1 細胞增殖能力比較

2.2 各組細胞侵襲能力比較 NC組細胞侵襲數(shù)量為(1.10±0.10)個，與NC組相比，HG組細胞侵襲數(shù)量[(51.32±5.14)個]顯著增加(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組(34.67±4.08)個、Rg3B組(19.36±2.94)個、Rg3C組(6.82±1.17)個細胞侵襲數(shù)量均逐漸降低(P<0.05)；Rg3C組細胞侵襲數(shù)量均低于Rg3A組和Rg3B組。見圖2。

圖2 Transwell小室法檢測細胞侵襲數(shù)量

2.3 各組細胞凋亡能力和周期比較 HG組細胞凋亡率較NC組顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞凋亡率均顯著增加，且呈遞增趨勢(P<0.05)，且Rg3C組細胞凋亡率明顯高于Rg3A組和Rg3B組(P<0.05)。HG組細胞G1期明顯高于NC組(P<0.05)；與HG組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞G1期均顯著降低(P<0.05)；Rg3C組細胞G1期

表1 各組細胞凋亡能力和周期比較

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.4 各組細胞中ROS含量比較 NC組細胞中ROS含量為(1.00±0.11)，與NC組相比，HG組細胞中ROS含量(110.23±5.15)顯著增加(P<0.05)；Rg3A組(72.81±4.06)、Rg3B組(56.27±2.97)、Rg3C組(23.46±1.38)細胞中ROS含量顯著低于HG組(P<0.05)；與Rg3A組和Rg3B組相比，Rg3C組細胞中ROS含量最低(P<0.05)。見圖4。

圖4 顯微鏡下細胞內(nèi)活性氧熒光強度(DCFH-DA探針染色，200×)

2.5 各組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN表達 與NC組相比，GH組細胞中Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白Nrf2和HO-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與GH組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達均顯著增加，且Rg3C組細胞中蛋白表達增加最顯著(P<0.05)(見圖5A、圖5B)。與NC組相比，GH組細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN明顯增加(P<0.05)；與GH組相比，Rg3A組、Rg3B組、Rg3C組細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN表達均顯著降低，且Rg3C組低于Rg3B組低于Rg3A組(P<0.05)。見圖5C、圖5D。

圖5 各組細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達及TGF-β、Ⅳ-C、FN表達

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者中最嚴重的一種微血管并發(fā)癥[11]。系膜細胞是腎小球內(nèi)固有的活躍功能細胞，其過度增殖是糖尿病腎病中重要的病理特征。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)系膜細胞的過度增殖，并對糖尿病腎病的發(fā)展有明顯的促進作用[12]。有學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的系膜細胞是觀察細胞增殖最優(yōu)的體外模型。因此，本研究采用人腎小球系膜細胞作為實驗細胞，同樣用高糖誘導(dǎo)系膜細胞發(fā)現(xiàn)其發(fā)生過度增殖，和前文結(jié)果一致。

文獻顯示，中醫(yī)可有效治療糖尿病腎病且療效確切，雖然部分中藥的成為較復(fù)雜，但中藥在臨床上的治療不僅可以對臨床癥狀進行改善，緩解患者的病情，而且還能對患者的腎臟進行保護。近些年，隨著天然藥物化學(xué)等領(lǐng)域的興盛，中藥在治療糖尿病腎病的治療上顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。人參皂苷Rg3主要提取于人參，是其中重要的活性成分之一，在減輕炎癥反應(yīng)、氧自由基和抗氧化等中有很好的療效[13]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠的腎臟病理損傷可用過人參皂苷Rg3進行改善，同時對大鼠的血糖、肌酐、24 h蛋白尿具有很好的抑制作用，進而對腎臟進行保護[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3能有效調(diào)控系膜細胞的生物學(xué)活性，提示其對腎小球系膜細胞的過度增殖有很好的抑制作用。冀楷等[15]研究證實，人參皂苷Rg3可有效抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細胞增殖，可預(yù)防并治療糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，進而發(fā)揮腎臟保護作用。TGF-β是高糖以及一些導(dǎo)致腎臟損傷的生化因素的重要遞質(zhì)，介導(dǎo)糖尿病腎病的生物活性等，TGF-β可作為檢測腎間質(zhì)纖維化成為的指標之一[16]。Ⅳ-C是腎小球基底膜膠原中重要成分之一，是基質(zhì)膠原中最典型的一種，可由多種細胞分泌和合成，例如活化的腎小球系膜細胞、上皮細胞等，因此Ⅳ-C合成和降解平衡出現(xiàn)失調(diào)，可導(dǎo)致糖尿病腎病腎小球發(fā)生病理性改變。FN是組成細胞外基質(zhì)的部分之一，正常狀態(tài)下系膜細胞會產(chǎn)生少量FN，在病理情況下系膜細胞產(chǎn)生FN的含量增多。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的人參皂苷Rg3均可抑制細胞中TGF-β、Ⅳ-C、FN表達。吳勝斌等[17]研究證實，人參皂苷Rg1可通過上調(diào)腎間質(zhì)HGF水平，抑制TGF-β1表達來延緩腎間質(zhì)纖維化進展，發(fā)揮腎組織保護作用。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ROS是氧化應(yīng)激中高活性分子之一，對腎細胞損傷有一定促進作用，且高糖會促進ROS的生成，進而破壞腎小球濾過膜，誘導(dǎo)蛋白尿的發(fā)生；大量的ROS會激活細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，增加ECM蛋白合成，減少其降解，進而對糖尿病腎病起促進作用[18]。Nrf2/ARE為機體內(nèi)重要的抗氧化信號通路，Nrf2可通過對ARE依賴的第Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄活性進行調(diào)控，如SOD、HO-1等，進而對氧化應(yīng)激反應(yīng)進行抑制。有研究[19]證實，Nrf2在組織對抗糖尿病氧化應(yīng)激損傷中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的人參皂苷Rg3均可抑制細胞中ROS含量，同時增加細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達，提示人參皂苷Rg3能通過抑制ROS含量和調(diào)控Nrf2/ARE信號通路的相關(guān)蛋白，加強人腎小球系膜細胞的抗氧化能力，進而減輕DN導(dǎo)致的氧化損傷。趙穎丹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5誘導(dǎo)腎小管上皮細胞出現(xiàn)氧化損傷，黃芪甲苷可抑制細胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機制是通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號通路來實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

人參皂苷Rg3可抑制高糖誘導(dǎo)的HMC細胞增殖、侵襲，促進HMC細胞凋亡，通過對細胞內(nèi)Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的調(diào)控加強系膜細胞的抗氧化能力。