王禹蒙 成姝婷 后望 駱芷寒 代澤詠 江舟 肖靜 汪宇輝 郭慧玲 劉延友

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·國家衛(wèi)生健康委員會(huì)時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

近日節(jié)律是生物體為適應(yīng)周期變化的自然環(huán)境而產(chǎn)生的重要生理機(jī)制[1]。研究證明，近日節(jié)律系統(tǒng)與包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的生殖具有十分密切的關(guān)系。為了更好的生存，物種通過漫長的進(jìn)化將繁殖時(shí)間優(yōu)化在具有溫和天氣的季節(jié)與充足的食物供應(yīng)期內(nèi)[2]，這需要近日節(jié)律系統(tǒng)對(duì)晝夜長度變化以及環(huán)境溫度變化具有精確的檢測能力[3]。Clock(Circadian locomotor output cycles kaput)基因作為一種核心近日鐘基因也在男性生殖中具有重要的作用[4]。不僅Clock 19/ 19突變可導(dǎo)致雄性小鼠生殖力受損，睪丸Clock基因表達(dá)量的下調(diào)也可顯著降低雄性小鼠的生殖能力[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，發(fā)現(xiàn)特異性敲降小鼠睪丸Clock基因后，雄鼠子代數(shù)量顯著減少可能是由于頂體蛋白酶活性降低而引起的受精率低下所致[7]。此外，我們還觀察到睪丸Clock基因敲降后小鼠精子的前向運(yùn)動(dòng)百分率顯著降低。精子的前向運(yùn)動(dòng)(Progressive motility，PR)是指精子細(xì)胞能夠積極地以線性方式或者大直徑圓周方式向前運(yùn)動(dòng)[8]，是反映精子運(yùn)動(dòng)能力的一個(gè)重要指標(biāo)，精子頸段或者尾段出現(xiàn)缺陷會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞的前向運(yùn)動(dòng)能力受損，從而使精子難以突破雌性生殖道內(nèi)不利的環(huán)境[9]。作為男性不育的一個(gè)可能因素，精子前向運(yùn)動(dòng)與Clock基因的關(guān)系研究報(bào)道尚少。本研究從小鼠睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)和睪丸Clock基因敲降小鼠精子差異蛋白功能聚類出發(fā)，探討睪丸Clock基因?qū)咏Y(jié)構(gòu)的影響以及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為今后研究近日節(jié)律系統(tǒng)與男性生殖系統(tǒng)的關(guān)系提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR雄性小鼠(8周齡)14只，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只，另2只小鼠作為免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)樣本。小鼠飼養(yǎng)于25℃ 12L:12D的光暗循環(huán)箱中，自由進(jìn)食飲水。正式實(shí)驗(yàn)前小鼠先經(jīng)過一周的環(huán)境適應(yīng)。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Clock干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒(廣州復(fù)能基因有限公司)；細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA)；Polyplusin vivo-jetPEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑(法國，Polyplus Transferion)；Clock敲降shRNA慢病毒[云舟生物科技(廣州)有限公司]；組織RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；小鼠α-KGDH酶聯(lián)反應(yīng)分析試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；Protein A+G磁珠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CLOCK Rabbit mAb(美國，Cell Signaling Technology)；CD274 Polyclonal Antibody(愛必信(上海)生物科技有限公司)；DLD Polyclonal Antibody(中國，Proteintech Group)；電鏡固定液(美國，ThermoFisher Scientific)；其它試劑為國產(chǎn)分析純，引物合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國，Bio-Rad technologies)；超微量紫外-可見光分光光度計(jì)Nanodrop One(美國，ThermoFisher)；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(德國，Eppendrof)；全波長酶標(biāo)儀(MD,美國)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)；微量注射器和手術(shù)器械等均為國產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獲得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后睪丸樣本 本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒后注射到睪丸的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法得到睪丸Clock基因下調(diào)的小鼠模型，由于該干擾質(zhì)粒敲降效果在注射轉(zhuǎn)染后第3 d達(dá)到峰值，故在第3 d獲取睪丸樣本。使用腹腔注射4%水合氯醛方式麻醉小鼠，每只小鼠注射10%水合氯醛200 μL,按照Polyplus in vivo-jetPEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將Clock干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒的質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物用微量注射器注射入兩組小鼠雙側(cè)睪丸中。繼續(xù)飼養(yǎng)3 d后，頸椎脫臼法處死小鼠，撕開小鼠腹部皮膚后摘取雙側(cè)睪丸。去除睪丸鞘膜及白膜后即刻切取一側(cè)睪丸中段放入室溫的電鏡固定液，將剩余的睪丸組織-80℃冷凍保存待檢。

1.2.2 透射電鏡檢查 睪丸組織在電鏡固定液中30 min后，將變硬的組織取出用手術(shù)刀切為薄片，再次放入電鏡固定液中4℃固定3 h。裝有睪丸樣本的容器采用冰袋冷藏運(yùn)輸?shù)姆绞剿椭廖錆h塞維爾生物科技有限公司完成制片和透射電鏡掃描成像。

1.2.3 小鼠Clock基因下調(diào)睪丸的精子蛋白組 數(shù)據(jù)再分析實(shí)驗(yàn)室前期曾對(duì)小鼠Clock基因下調(diào)睪丸的精子進(jìn)行了蛋白組檢測，我們將其差異表達(dá)基因(DEGs)數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)進(jìn)行GO和KEGG的功能富集分析，其中GO包括BP(生物學(xué)功能)、CC(細(xì)胞組分)和MF(分子功能)。所得結(jié)果按照假陽性率(FDR)<0.001進(jìn)行篩選。根據(jù)篩選結(jié)果選擇關(guān)鍵基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測 每只雄鼠樣本取出約100 mg-80℃冷凍的睪丸組織，液氮冷凍研磨成粉，并用組織RNA提取試劑盒按提取組織總RNA。使用Nanodrop One檢測總RNA的濃度與純度，并以RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用RT-qPCR試劑盒對(duì)睪丸中的Clock基因和Dld基因表達(dá)量進(jìn)行檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)設(shè)置如下：95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 10sec/60℃ 30sec循環(huán)反應(yīng)(共40個(gè)循環(huán))；儀器默認(rèn)程序采集溶解曲線。引物序列如下：ClockForward：ATGGTGTTTACCG TAAGCTGTAG，ClockReverse：CTCGCGTTACCA GGAAGCAT；Dld Forward：CGATGGCAGCACTC AGGTTA，Dld Reverse：CTGAACCCAGTTCCACA CCA；GapdhForward：TGCGACTTCAACAGCAAC TC，GapdhReverse：ATGTAGGCAATGAGGTCCAC。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 每只雄鼠樣本取出約1 g -80℃冷凍的睪丸組織，加入9 mL PBS緩沖液在冰上進(jìn)行勻漿；轉(zhuǎn)移勻漿液至離心管中，4℃ 2500 rpm離心20 min，去除上清液，收集沉淀；用PBS緩沖液洗滌沉淀3次后，在冰上使用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎(設(shè)置工作2 s，冷卻30 s)，破碎后液體在4℃ 2500 rpm離心20 min，收集上清液用于α-KGDH活性的ELISA檢測。按照小鼠α-KGDH酶聯(lián)反應(yīng)分析試劑盒說明書步驟進(jìn)行上樣、加酶、洗滌顯色等操作，并以酶標(biāo)儀450 nm波長測量吸光度。每個(gè)樣本設(shè)置3復(fù)孔。

1.2.6 免疫共沉淀 將冷凍于-80℃的雄鼠睪丸組織樣本取出約500 mg，液氮冷凍研磨后，加入600μL RIPA：PMSF=100：1蛋白裂解液裂解組織并收集裂解液。將Protein A+G磁珠解凍并取兩管各20 μL，分別使用1×TBS清洗3次。將500 μL CLOCK Rabbit mAb抗體工作液和500 μL CD274 Polyclonal Antibody 抗體工作液分別與兩管20 μL磁珠懸液混合,分別標(biāo)記為“CLOCK”與“IgG”。將蛋白裂解液與“IgG”標(biāo)記的磁珠-抗體混和液共同4℃孵育1 h，磁性分離后取上清液。然后將上清液再與“CLOCK”標(biāo)記的磁珠抗體混合液共同4℃孵育過夜。孵育完成后將混合液95℃水浴加熱5 min后磁性分離，取上清液使用DLD Polyclonal Antibody進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)以定性檢測樣本中是否存在DLD蛋白。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組睪丸Clock基因被有效敲降 通過RT-qPCR，以Gapdh為內(nèi)參檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組雄鼠睪丸組織中Clock基因的mRNA表達(dá)量。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Clock基因的表達(dá)顯著降低(P<0.001)，說明我們獲取的實(shí)驗(yàn)組雄鼠睪丸組織中的Clock基因在mRNA水平被成功降低了，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組睪丸組織Clock基因相對(duì)表達(dá)量

2.2 實(shí)驗(yàn)組精子超微結(jié)構(gòu)中線粒體出現(xiàn)異常對(duì)于透射電鏡所展示出的兩組睪丸切片組織中的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)位于精子尾部中段的線粒體結(jié)構(gòu)有異。實(shí)驗(yàn)組睪丸精子中多處線粒體之間出現(xiàn)較大間隙(見圖2A)，且有雙層排布現(xiàn)象(見圖2C)，這些線粒體大小不均，有部分甚至出現(xiàn)明顯固縮現(xiàn)象(見圖2B、圖2C)；而對(duì)照組精子線粒體結(jié)構(gòu)及排布未見明顯異常(見圖2D)。兩組睪丸組織中精子尾部軸絲的“9+2”微管結(jié)構(gòu)均未見異常。

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠睪丸精子尾部中段電鏡圖

2.3 DEGs的功能注釋再分析結(jié)果 利用本實(shí)驗(yàn)室前期檢測所得的小鼠Clock基因下調(diào)睪丸的精子蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)再分析。通過DAVID在線功能注釋工具，我們將篩選出的差異蛋白的DEGs顯著富集聚類到了5條CC條目(見圖3A)和3條BP條目(見圖3B)中，MF則未能富集到條目。DEGs在8條KEGG條目中顯著富集(見圖3C)，包括：氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)、碳代謝(Carbon metabolism)、抗生素生物合成(Biosynthesis of antibotics)、代謝通路(Metabolic pathways)、乙醛酸鹽與雙羧酸代謝(Glyoxylate and dicarboxylate metabo-lism)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、檸檬酸循環(huán)(TCA cycle)和糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluco-neogenesis)。在富集程度最顯著的TCA循環(huán)通路中，我們選擇關(guān)鍵差異蛋白DLD作后續(xù)驗(yàn)證。

圖3 DEGs GO CC BP KEGG Pathway富集氣泡圖(FDR<0.001)

2.4 兩組睪丸α-KGDH酶活性比較 由于DLD為α-KGDH的關(guān)鍵亞基，通過ELISA檢測，測量了兩組小鼠睪丸組織中的α-KGDH活性。實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸組織樣本中的α-KGDH活性(24.263±2.933)U/L與對(duì)照組(29.666±4.505)U/L比較顯著降低(P<0.05)。

2.5 兩組睪丸Dld基因mRNA水平比較 通過RT-qPCR，對(duì)兩組小鼠睪丸組織中Dld基因mRNA水平進(jìn)行了檢測。相對(duì)于對(duì)照組小鼠，實(shí)驗(yàn)組的Dld基因表達(dá)量也出現(xiàn)了明顯的降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組睪丸組織Dld基因相對(duì)表達(dá)量

2.6 CLOCK蛋白與DLD蛋白能夠相互作用 在小鼠睪丸組織樣本CLOCK蛋白沉淀產(chǎn)物中檢測到了DLD蛋白存在，說明CLOCK蛋白與DLD蛋白存在相互作用，見圖5。

圖5 小鼠睪丸組織CLOCK蛋白與DLD蛋白Co-IP結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，敲降雄性小鼠睪丸Clock基因不僅會(huì)因其精子頂體蛋白酶活性降弱而導(dǎo)致受精率降低，其精子的前向運(yùn)動(dòng)百分率也受到了影響[10]。前向運(yùn)動(dòng)率過低的精子活動(dòng)能力較弱，可能導(dǎo)致精子難以完成正常的受精作用，從而在一方面導(dǎo)致不育的發(fā)生[11]。支持精子活動(dòng)的能量由ATP提供，精子內(nèi)的ATP由糖酵解和氧化磷酸化形成。糖酵解主要發(fā)生部位位于精子尾部鞭毛，但供能較少。大部分ATP的產(chǎn)生均由尾部中段線粒體中的氧化磷酸化產(chǎn)生[12-13]，有研究人員推測，具有更大體積尾部中段的精子具有更高的線粒體密度，這可以使精子的運(yùn)動(dòng)能力提升[14]。由此可推測，精子頸部及尾部的結(jié)構(gòu)變化均可能導(dǎo)致能量代謝的異常，于是我們通過透射電鏡觀察以求證實(shí)Clock基因低表達(dá)對(duì)精子結(jié)構(gòu)可能造成的影響。

本實(shí)驗(yàn)在使用siRNA干擾質(zhì)粒下調(diào)小鼠睪丸Clock基因的表達(dá)后，以透射電鏡的方法對(duì)該組小鼠的睪丸組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該組睪丸組織內(nèi)精子細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為精子尾部中段的線粒體排列混亂、部分線粒體出現(xiàn)雙層排列、空泡化和萎縮，線粒體腔內(nèi)有凋亡小體形成。線粒體是為精子供能的主要細(xì)胞器，精子細(xì)胞中大約 15%～22% 的總體積被線粒體占據(jù)[15]。精子線粒體功能的缺陷會(huì)嚴(yán)重?fù)p害精子所需的能量產(chǎn)生，并且可能是弱精子癥的潛在原因[16]。

為了研究睪丸Clock基因低表達(dá)引起睪丸內(nèi)精子線粒體結(jié)構(gòu)和排列發(fā)生異常的原因，將實(shí)驗(yàn)室前期研究所得的睪丸Clock基因敲降小鼠的精子蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行了再挖掘。將這些數(shù)據(jù)的DEGs整理后通過DAVID在線分析工具進(jìn)行了GO和KEGG條目的聚類富集，并以FDR<0.001對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些DEGs的細(xì)胞組分大多來自精子纖維鞘、纖毛、線粒體等，這與我們電鏡結(jié)果顯示的精子超微結(jié)構(gòu)異常相符，而BP的結(jié)果提示這些DEGs可能會(huì)影響到糖代謝，這也就提示了該線粒體可能不僅存在結(jié)構(gòu)的異常，其功能可能受到了影響。KEGG的富集結(jié)果更是強(qiáng)烈提示三羧酸循環(huán)的信號(hào)通路存在異常，因此我們查看了參與此信號(hào)通路的DEGs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)限速酶之一的α-KGDH復(fù)合體的一個(gè)亞基組成蛋白DLD。α-KGDH作為物質(zhì)與能量代謝中十分重要的一個(gè)酶復(fù)合體，其在TCA循環(huán)與氨基酸代謝中均起著關(guān)鍵調(diào)控的作用[17-19]。另外由于在TCA循環(huán)中α-KGDH能將酮戊二酸在NAD+與CoA的作用下催化為琥珀酰CoA[20-21]，由此也對(duì)表觀遺傳中蛋白質(zhì)琥珀?；哂嘘P(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。推測Clock基因可能是通過對(duì)α-KGDH酶活性的調(diào)節(jié)而影響線粒體的代謝產(chǎn)能的。接下來，檢測了實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸中α-KGDH的酶活性，發(fā)現(xiàn)確實(shí)比對(duì)照組出現(xiàn)了明顯的降低。我們又在實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸組織中驗(yàn)證了Dld基因轉(zhuǎn)錄本水平的降低，這與前期蛋白組結(jié)果數(shù)據(jù)中DLD的變化趨勢相一致。因此，Clock基因很可能可以通過對(duì)Dld基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)而影響DLD蛋白的表達(dá)量。那么，Clock基因是否還能夠影響DLD蛋白的功能呢？為此，我們還以免疫共沉淀的方法研究了CLOCK蛋白與DLD蛋白的相互作用。結(jié)果表明CLOCK蛋白與DLD蛋白在自然情況下確實(shí)存在相互作用。

4 結(jié)論

睪丸Clock基因?qū)τ诰泳€粒體的形態(tài)及功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。睪丸Clock基因的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致精子線粒體超微結(jié)構(gòu)的異常，并通過對(duì)DLD蛋白表達(dá)量和功能的調(diào)節(jié)影響α-KGDH的酶活性，最終導(dǎo)致小鼠精子因線粒體三羧酸循環(huán)異常而出現(xiàn)前向運(yùn)動(dòng)百分率降低。