隋曉露, 許云鵬, 張燕子, 張艾莎, 謝婷妃, 袁樹(shù)珍,鄒杰鋒, 曾啟城, 陳繼紅

(深圳大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科, 廣東 深圳, 518000)

腎間質(zhì)炎癥和腎間質(zhì)纖維化是尿酸性腎病的主要病理?yè)p害機(jī)制，信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥損傷機(jī)制是其病理?yè)p害發(fā)生的重要原因。目前，已知多種信號(hào)通路在尿酸性腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[1]。PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞的凋亡、增殖、分化和遷移等過(guò)程。本研究通過(guò)“腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃”建立尿酸性腎病大鼠動(dòng)物模型，觀察尿酸性腎病大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路基因、蛋白和炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平，探討 PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路在尿酸致腎臟細(xì)胞炎癥損傷中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

雄性SD大鼠36只，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量180～200 g, 恒溫環(huán)境下標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)1周。36只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組18只。本研究方案經(jīng)深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審查通過(guò)。

實(shí)驗(yàn)組大鼠予腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃建立大鼠高尿酸性腎病模型。腺嘌呤 10 g、乙肝丁醇 25 g, 加生理鹽水定容至1 L,-20 ℃分裝保存，使用前恢復(fù)至室溫。按腺嘌呤100 mg/kg+乙肝丁醇250 mg/kg, 每日1次灌胃，連用28 d。給藥前、腺嘌呤+乙胺丁醇灌胃28 d時(shí)采血，檢測(cè)血漿中黃嘌呤氧化酶(XO)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN), 上述指標(biāo)顯著高于對(duì)照組提示造模成功。對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 標(biāo)本收集及處理

采集頸靜脈血，每次1 mL, 肝素抗凝后提取血漿,-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，摘取雙側(cè)腎臟，取部分腎臟觀察腎臟組織病理學(xué)改變，剩余腎臟-80 ℃凍存。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè): 采集新鮮靜脈血，肝素抗凝后提取血漿，檢測(cè)血漿中XO、UA、Cr和BUN水平。

1.3.2 腎臟組織病理學(xué): 取各組新鮮腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)和皮髓交界處標(biāo)本，用 10%福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后，觀察腎臟各部位的組織病理學(xué)改變。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)基因表達(dá)水平: 總RNA抽提。勻漿器加入1 mL Trizol Reagent, 置冰上預(yù)冷。取約100 mg新鮮腎臟于勻漿器中充分研磨，離心取上清，加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩45 s, 使其充分混勻呈乳狀，室溫靜置3 min。4 ℃下12 000轉(zhuǎn)/min, 離心10 min, 上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻,-20 ℃放置5 min, 4 ℃下12 000轉(zhuǎn)/min, 離心10 min, 管底白色沉淀即為RNA。吸除上清液，加入75%乙醇1 mL顛倒混勻，使沉淀懸浮。4 ℃下12 000轉(zhuǎn)/min, 離心5 min, 棄上清液，吸凈管底乙醇，離心管置于超凈臺(tái)上吹3 min, 晾干沉淀。加入50 μL無(wú)RNA酶的水溶解RNA, Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度，濃度過(guò)高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，終濃度為100 ng/μL。反轉(zhuǎn)錄: PCR管加入含100 ng RNA以上的溶液作為反轉(zhuǎn)錄的模板。加入1 μL 特異性miRNA反轉(zhuǎn)錄引物，無(wú)核糖核酸酶去離子水補(bǔ)足至12 μL, PCR儀上65 ℃保溫5 min, 迅速置冰上冷卻。依次加入4 μL 5×ES Reaction Mix, 2 μL 10 mmol/L dNTPs, 1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，移液槍抽吸混勻。PCR儀上42 ℃保溫60 min, 結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。定量PCR: 取0.2 mL PCR管，配制反應(yīng)體系(2×qPCR Mix 12.5 μL, 7.5 μmol/L基因引物2.0 μL, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL, 雙蒸水8.0 μL), 每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。PCR擴(kuò)增: 預(yù)變性95 ℃ 5 min, 循環(huán)(44次)95 ℃, 15 s→56 ℃, 30 s→72 ℃ 20 s, 熔解曲線75 ℃→95 ℃, 每20 s升溫1 ℃?！鳌鰿T法進(jìn)行結(jié)果處理。

1.3.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)各組PI3K、AKT和NF-κB 蛋白表達(dá)水平: 組織總蛋白提取。新鮮腎臟約100 mg用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器中，加入蛋白質(zhì)裂解液(RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑按100∶1∶1的比例配置)，冰浴徹底勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min, 期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。4 ℃下13 000 g離心5 min, 收集上清液(總蛋白溶液)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE): 根據(jù)樣品濃度確定上樣量，在蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液, 100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠加入四甲基乙二胺(TEMED)后立即搖勻灌膠。配制濃縮膠加入TEMED后立即搖勻灌膠，剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。拔出梳子，將電泳架放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，將樣品加入點(diǎn)樣孔中。按濃縮膠50 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜: 甲醇活化聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜，按照正負(fù)極的方向擺放轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu), 100 V恒壓轉(zhuǎn)膜?？贵w孵育: 轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液，室溫封閉1 h, 除去封閉液，加入已稀釋的一抗4 ℃過(guò)夜?；厥找豢?，用洗膜緩沖液(TBST)洗3次，每次5 min, 加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min, TBST在室溫下?lián)u床洗4次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè): 滴加新鮮配制的ECL混合溶液于膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝光、顯影和定影。Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-1β前體(Pro-IL-1β)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)水平: 取約100 mg新鮮腎臟樣本置于勻漿器內(nèi)充分研磨, 5 000轉(zhuǎn)/min, 4 ℃離心5 min, 取上清液，按ELISA試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)IL-6、TNF-α、MCP-1、Pro-IL-1β、IL-1β和TGF-β1 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血漿中BUN、Cr、UA和XO水平測(cè)定

給藥前, 2組BUN、Cr、UA和XO水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后，實(shí)驗(yàn)組BUN、Cr、UA和XO水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠給藥前后BUN、Cr、UA、XO水平

2.2 PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路mRNA表達(dá)水平測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組PI3K、AKT和NF-κBmRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠PI3K、AKT、NF-κB mRNA表達(dá)水平

2.3 PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組PI3K、AKT和NF-κB 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 2組大鼠PI3K、AKT、NF-κB蛋白表達(dá)水平

2.4 PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組TNF-α、MCP-1、IL-6、Pro-IL-1β和IL-1β水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 2組大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平 pg/mL

2.5 2組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

對(duì)照組大鼠腎小管上皮結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)萎縮，未見(jiàn)明顯空泡變，管內(nèi)無(wú)尿酸鹽結(jié)晶，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

實(shí)驗(yàn)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)不同程度變性壞死及囊性擴(kuò)張，擴(kuò)張小管內(nèi)大量管型; 腎間質(zhì)可見(jiàn)以中性粒細(xì)胞為主的大面積炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等亦可見(jiàn); 間質(zhì)纖維增生，腎皮髓質(zhì)、間質(zhì)及小管內(nèi)可見(jiàn)大小不等棕色結(jié)晶沉積，部分腎集合管內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型及紅細(xì)胞管型; 腎小球不同程度增大，腎小球囊壁層細(xì)胞肥大，內(nèi)膜增厚，伴少量血漿滲出。見(jiàn)圖1。

A、B: 對(duì)照組大鼠腎臟組織HE染色; C、D: 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織HE染色。

3 討 論

高尿酸水平可導(dǎo)致多種靶器官功能損害，其主要發(fā)病機(jī)制有尿酸鹽沉積、免疫紊亂、炎癥損傷、腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。細(xì)胞吞噬尿酸鹽晶體可通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)及巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增高，激發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致臟器損傷[2]。腎小管細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞尿酸晶體并釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌紊亂又可造成細(xì)胞外基質(zhì)合成降解失衡，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和腎間質(zhì)纖維化[3-4]。

轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF)/smad、酪氨酸激酶(Syk)和寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)/Toll樣受體(TLRs)等多種信號(hào)通路參與尿酸性腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5]。PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路已證實(shí)參與尿酸性腎病的發(fā)病過(guò)程。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異二聚體，可接受來(lái)自G蛋白連接受體、酪氨酸激酶連接受體傳遞的信號(hào)，通過(guò)與連接蛋白相互作用，使二聚體構(gòu)象改變而激活。AKT是PI3K的靶蛋白，可接收PI3K傳遞的生物信息，通過(guò)磷酸化途徑被激活。NF-κB可與基因啟動(dòng)子固定核苷酸序列結(jié)合，調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞因子，激活相關(guān)炎性細(xì)胞分化，引發(fā)炎癥反應(yīng)[6-8]。

本研究通過(guò)建立尿酸性腎病大鼠動(dòng)物模型，觀察尿酸性腎病大鼠PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路目標(biāo)基因mRNA、蛋白表達(dá)、炎性細(xì)胞因子水平變化和大鼠腎臟病理變化情況。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因PI3K、AKT和NF-κBmRNA表達(dá)水平增高及其蛋白表達(dá)增加，炎性細(xì)胞因子NF-α、MCP-1、TGF-β1、IL-6、Pro-IL-1β和IL-1β表達(dá)水平增高。HE染色病理結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞不同程度變性壞死及囊性擴(kuò)張，腎間質(zhì)可見(jiàn)以中性粒細(xì)胞為主的大面積炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維增生，腎皮髓質(zhì)、間質(zhì)及小管內(nèi)可見(jiàn)大小不等棕色結(jié)晶沉積，腎小球不同程度增大，腎小球囊壁層細(xì)胞肥大，內(nèi)膜增厚，伴少量血漿滲出。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎小管細(xì)胞可內(nèi)吞尿酸結(jié)晶，可能通過(guò)激活PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路并釋放炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和腎間質(zhì)纖維化。其可能的機(jī)制如下: ① PI3K與酪氨酸殘基受體結(jié)合后，生成磷酸化的磷脂產(chǎn)物，磷脂產(chǎn)物可將AKT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上[9]，在磷酸肌醇依賴性酶的作用下，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移并發(fā)生血管重構(gòu)。在腎間質(zhì)和腎小管內(nèi)，入球小動(dòng)脈管壁增厚，引起管腔狹窄甚至管腔閉塞，導(dǎo)致腎灌注嚴(yán)重不足，促使腎纖維化，進(jìn)而加重腎損害[10-12]。② 在高尿酸誘導(dǎo)的腎組織炎性損害中, NF-κB激活可引起一系列的酶促反應(yīng)。胞內(nèi)NF-κB誘導(dǎo)性激酶激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物，經(jīng)過(guò)磷酸化、泛素化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與基因上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，促使腎小管上皮細(xì)胞賴氨酰氧化酶和MCP-1蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白合成增加，基質(zhì)蛋白沉積加速腎間質(zhì)纖維化[12-14]; ③ 在PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路激活狀態(tài)下，單核-巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β明顯增加，可反過(guò)來(lái)進(jìn)一步活化NF-κB, 形成炎癥信號(hào)的正反饋，腎間質(zhì)單核胞浸潤(rùn)導(dǎo)致炎癥損傷，加劇腎間質(zhì)炎性損傷和腎組織纖維化[13-14]。TNF-α還可使血管內(nèi)皮舒張功能減退，從而影響腎臟血流動(dòng)力學(xué)，使腎小球?yàn)V過(guò)率下降，加劇腎間質(zhì)炎性損傷和腎組織纖維化[15]。④ IL-6、TGF-β1是導(dǎo)致腎小球硬化和腎臟疾病惡化的重要因素[16]。IL-6可通過(guò)自分泌與旁分泌的方式與TGF-β1相互作用，兩者相互促進(jìn)引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇腎臟纖維化進(jìn)程，同時(shí)還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的促凝血活性，并增加系膜細(xì)胞蛋白激酶活性，加重腎損害[16-17]。

高尿酸激活PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，通過(guò)誘導(dǎo)血管重構(gòu)、激活酶促反應(yīng)、改變血流動(dòng)力學(xué)和引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等途徑，引起腎灌注不足、細(xì)胞外基質(zhì)沉積加速和腎間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)等后果，導(dǎo)致腎間質(zhì)炎性損傷和腎間質(zhì)纖維化，這可能為尿酸性腎病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，未來(lái)或?qū)⒊蔀槟蛩嵝阅I病干預(yù)及治療靶點(diǎn)。