高 吟, 張立紅, 張志斌, 胡錫池

(1.江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗科, 江蘇 無錫, 214000;2.江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院 檢驗科, 江蘇 無錫, 214000)

鮑曼不動桿菌是革蘭陰性條件致病菌, 無鞭毛，幾乎無動力，在大自然中廣泛存在[1]。鮑曼不動桿菌是重癥監(jiān)護室院內(nèi)感染主導(dǎo)細菌之一[2]?？股氐臑E用易導(dǎo)致鮑曼不動桿菌產(chǎn)生多重耐藥性[3]。耐碳青霉烯類抗菌藥物對β-內(nèi)酰胺酶作用穩(wěn)定，臨床上分離出耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)的數(shù)量逐年上升[4]。小柴胡湯出自東漢名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗等中藥組成，可用于治療傷寒少陽證，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[5-6]。本研究探討小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁對CRAB的體外抑菌效果及對生物膜的清除作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及藥物來源

本研究隨機選取江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院2019年1月—2021年4月分離出的不同樣本來源的鮑曼不動桿菌菌株，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。樣本來源于痰液、尿液、腦脊髓、傷口膿液等標(biāo)本。參考文獻[7]進行小柴胡湯的藥物配制。按照小柴胡湯藥加水煎煮2次，每次1.5 h, 濾液濃縮; 半夏、生姜用75%乙醇浸泡24 h, 收集提取液，回收乙醇，與上述濃縮液合并，濃縮至60 ℃下相對密度為1.08～1.10的藥液，噴霧干燥，制成干浸膏粉，備用。注射用亞胺培南西司他丁(上海輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20067765)。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃); 96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司); 半自動多點接種儀(日本株式會社); 全功能微孔板檢測酶標(biāo)儀(美國Biotek公司); 德國Eppendorf公司PCR擴增儀。

1.3 CRAB菌株鑒定和菌懸液的配置

將采集的樣本接種于麥康凱培養(yǎng)基進行細菌分離和培養(yǎng)，根據(jù)菌落具體形態(tài)選擇疑似鮑曼不動桿菌的菌落進行初步分離，接種于鮑曼不動桿菌顯色培養(yǎng)皿, 35 ℃下恒溫孵育24 h。采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定。所有操作嚴(yán)格遵循使用說明書，且同一患者多次送檢標(biāo)本檢出同一菌株按1株計算。將鑒定出的鮑曼不動桿菌進行耐藥檢驗，最終獲得60株非重復(fù)CRAB，接種至菌種保存管中，置于超低溫冰箱中保存。

將凍存CRAB菌株復(fù)蘇3代后，挑選4～5個菌落，接種于滅菌MHB肉湯中, 37 ℃ 培養(yǎng)箱增菌6 h, 此時細菌處于對數(shù)生長期，菌液采用比濁儀調(diào)整濁度至0.5麥?zhǔn)蠞舛群?，再以MHB肉湯稀釋，最終將菌懸液濃度調(diào)整為1×106CFU/mL備用。

1.4 抗菌藥物制備

A組藥物為小柴胡湯中藥提取物，最終稀釋濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個濃度。B組藥物為亞胺培南西司他丁，最終濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個濃度，備用。

1.5 微量棋盤稀釋法

依據(jù)96孔板棋盤法將配制好的不同濃度的小柴胡湯(A組藥)與亞胺培南西司他丁抗菌藥物(B組藥)兩兩組合，第1列加入A組藥，最后一排加入B組藥，藥物濃度由低到高，用來測定單藥最低抑菌濃度(MIC)值; 將制備好的CRAB菌液加入96孔平板的1～11列中。最后一排加入質(zhì)控菌，分別設(shè)陽性對照(只加細菌，無藥物)和陰性對照(只加肉湯，無細菌)。挑選適量菌落于肉湯中稀釋，使最終每個孔內(nèi)菌液濃度為5×105CFU/mL, 震蕩后放入37 ℃孵育箱中培養(yǎng)20 h, 觀察結(jié)果。

1.6 聯(lián)合用藥的藥效評估

記錄單獨應(yīng)用2種藥物的MICA和MICB, 并記錄96孔板中聯(lián)合區(qū)域中最佳組合效應(yīng)時2種藥物各自的MIC值，并計算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)。FIC=A組藥聯(lián)合時MIC值/A組藥單用時MIC值+B組藥聯(lián)合時MIC值/B組藥單用時MIC值。當(dāng)FIC≤0.5時，即2種抗菌藥物為協(xié)同作用; 當(dāng)FIC>0.5～1.0時，即2種抗菌藥為相加作用; 當(dāng)FIC>1.0～2.0時，即2種抗菌藥為無關(guān)作用; 當(dāng)FIC>2.0時，即2種抗菌藥物為拮抗作用。

1.7 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用及聯(lián)合作用后生物膜抑制實驗[8]

將小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合效果為協(xié)同作用的CRAB接種于MHB培養(yǎng)基中，并接種質(zhì)控菌株，在37 ℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)20 h, 采用比濁儀將菌液濃度調(diào)整為1.0×106CFU/mL, 加入無菌96孔細菌培養(yǎng)板，采用MHB培養(yǎng)基分別將小柴胡湯稀釋成1/4、1/16的MIC系列濃度，將亞胺培南西司他丁稀釋成1/4 MIC、1/16 MIC等系列濃度。以棋盤法將不同濃度的小柴胡湯和亞胺培南西司他丁進行兩兩組合, 37 ℃培養(yǎng)24 h, 每株菌株設(shè)立3個復(fù)孔，使用結(jié)晶紫染色法進行測定，酶標(biāo)儀測定570 nm下吸光度，采用A570代表生物被膜生物量, A570越高表示生物膜越強。

1.8 細菌DNA的提取及實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測耐藥基因轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)細菌DNA提取試劑盒(購自上海翌圣生物科技股份有限公司)操作步驟提取細菌DNA, 采用50 μL常規(guī)反應(yīng)體系。設(shè)置PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃, 5 min預(yù)變性; 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火35 s, 65 ℃延伸30 s, 擴增35個循環(huán); 最后72 ℃下繼續(xù)延伸10 min。引物序列如下,adeJ: 上游序列為5′-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3′, 下游序列為5′-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3′;CarO: 上游序列為5′-GACAACTACAGCTTTACTGCT-3′, 下游序列為5′-ACACCAACTTTACCAACTGG-3′; 內(nèi)參基因選擇16S rRNA: 上游序列為5′-CCTACCAAGGCGACGATCTGT-3′, 下游序列為5′-AACGCTCGCACCCTCTGTATT-3′。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同藥物對CRAB的MIC比較

小柴胡湯單獨用藥對CRAB生長有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL, 而亞胺培南西司他丁對CRAB的MIC為16 μg/mL, 見表1。

表1 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁藥物對CRAB的MIC比較

2.2 小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB, 小柴胡湯濃度分別為8.00、4.00 μg/mL而亞胺培南西司他丁濃度分別2.00、1.00 μg/mL時，可抑制 CRAB的生長。不動桿菌藥敏FIC=4/32+2/16=0.25, FIC≤0.5, 提示2種藥物有協(xié)同作用，見表2。

表2 小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

2.3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB后對生物膜形成能力的影響

1/16 MIC、1/4 MIC的小柴胡湯單獨作用于CRAB的吸光度與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.611、2.812,P>0.05); 1/16 MIC、1/4 MIC的亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB的吸光度與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.777、2.717,P>0.05)。見表3。

表3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨作用于CRAB對生物膜形成能力的影響

2.4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用對CRAB生物膜形成能力的影響

與單獨應(yīng)用1/16 MIC亞胺培南西司他丁比較，加入1/16、1/4或1 MIC小柴胡湯聯(lián)合1/16 MIC亞胺培南西司他丁后的A570值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.513、10.515、19.802,P<0.05)。與單獨應(yīng)用1/16 MIC小柴胡湯比較，加入1/16、1/4或1 MIC亞胺培南西司他丁聯(lián)合1/16 MIC小柴胡湯后的A570值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.109、5.657、15.461,P<0.05)。見表4。

表4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB的A570值比較

2.5 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨用藥和聯(lián)合用藥對CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉(zhuǎn)錄水平的影響

采用RT-PCR檢測小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨用藥和聯(lián)合用藥對CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果顯示，與生長對照組相比，亞胺培南西司他丁組中adeJ和CarO呈低表達，聯(lián)合組adeJ和CarO呈高表達。小柴胡湯與生長對照組adeJ、CarO相對表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 其他各組adeJ、CarO兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A: 各組adeJ基因相對表達水平比較; B: 各組CarO基因相對表達水平比較。兩者比較, *P<0.05。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯單獨用藥對CRAB有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL; 亞胺培南西司他丁對CRAB的MIC為16 μg/mL; 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB可發(fā)揮協(xié)同作用。亞胺培南西司他丁是碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強及耐受性良好等特點，被廣泛應(yīng)用于革蘭陽性菌、陰性菌及厭氧菌的治療，亦是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的有效藥物[9-10]。中藥作為新的抗菌劑來源，與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用可以彌補常規(guī)抗生素治療的缺陷，提高抗生素的治療效果。小柴胡湯主要用于治療少陽病寒熱往來、胸脅苦滿、不欲飲食、心煩喜嘔、口苦、咽干、目眩等癥狀，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[11-12]。方中柴胡味苦微寒，可疏解少陽; 黃芩苦寒，氣味較重，可清泄邪熱; 半夏、生姜調(diào)和胃氣，可降逆止嘔; 人參、炙甘草、大棗益氣和中，可扶正祛邪[13-14]。全方攻補兼施，升降協(xié)調(diào)，宣通內(nèi)外，為和解良方。藥理研究[15]證實，小柴胡湯具有保護肝損傷、抗胃潰瘍、抗幽門螺桿菌、抗抑郁、抗菌和抗炎等作用。本研究顯示，小柴胡湯單獨使用對CRAB有一定的抑菌作用，而小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用可發(fā)揮協(xié)同作用，增強抗生素的抑菌效果。

本研究進一步探討小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用發(fā)揮抗菌效果的機制，結(jié)果表明，小柴胡湯和亞胺培南西司他丁可進一步激活adeJ、CarO基因，考慮小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用后可降低亞胺培南西司他丁單獨用藥對CRAB的MIC, 可能是外膜孔蛋白基因CarO的激活發(fā)揮了主要作用，使小柴胡湯有效成分進入菌體內(nèi)，從而聯(lián)合亞胺培南西司他丁共同發(fā)揮抑制細菌生長的作用。外排泵可以輸送多種化合物，與細菌多重耐藥性有關(guān)。既往研究[16]表明,CarO表達下調(diào)導(dǎo)致進入細菌體內(nèi)的亞胺培南量減少，達不到抑菌所需對的濃度，從而使細菌產(chǎn)生耐藥性。以上研究均表明, 2種藥物聯(lián)用激活了部分外排泵基因表達，對細菌具有一定抑制作用。

生物膜的生成使細菌對常用抗菌藥物具有更強的抵抗力，增強細菌的耐藥性[17]。本研究針對形成生物膜的CRAB進行生物膜抑制實驗，結(jié)果表明，小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁具有抗菌協(xié)同作用，有抑制和清除CRAB生物膜的作用。小柴胡湯或亞胺培南西司他丁單獨使用時，對生物膜的抑制作用無顯著差異，可能是生物膜阻礙了藥物進入，導(dǎo)致殺菌作用被抑制。細菌生物膜是指細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面，由細菌自身分泌的胞外多糖基質(zhì)組成的細菌群體，是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的極好環(huán)境，可獲得耐藥基因[18-19]。臨床分離的鮑曼不動桿菌幾乎都有形成生物膜的能力, 48 h內(nèi)就能夠形成成熟的生物膜，且生物膜形成后需要極高的藥物濃度才可清除，而體內(nèi)的藥物濃度通常達不到清除所需的濃度，且高藥物濃度將會帶來嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且使耐藥基因水平轉(zhuǎn)移并演變出生物膜形成能力高的耐藥菌株。因此，臨床醫(yī)師在治療此類患者時應(yīng)改變治療方針，除了將治療重點放在預(yù)防及診斷上外，也需要及時治療急性感染，盡量杜絕慢性感染的出現(xiàn)以避免生物膜的形成。

綜上所述，小柴胡湯聯(lián)用亞胺培南西司他丁表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用，在清除生物膜方面，小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁雖然可提高生物膜清除率，但其不良反應(yīng)很嚴(yán)重。小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁可對CRAB發(fā)揮抑菌作用，其機制可能是通過激活部分外排泵基因表達而實現(xiàn)的。