魯 瑞， 黨雙鎖， 劉怡欣， 王怡愷， 劉晨瑞， 李亞萍， 吳鳳萍， 李 梅

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 感染科， 西安 710004

富馬酸替諾福韋酯(TDF)具有強(qiáng)效、極低耐藥、安全性高、給藥方便、價(jià)格便宜等特點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外指南推薦的一線抗HBV藥物[1-2]。本研究擬觀察CHB患者使用TDF抗病毒治療3年HBV DNA和HBsAg的動(dòng)態(tài)變化。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月—2020年8月就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院的單用TDF治療的CHB患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[1]中的CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥18歲；(3)單用TDF(富馬酸替諾福韋二吡呋酯片，齊魯制藥有限公司)抗病毒治療≥3年；(4)病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往使用過(guò)其他核苷(酸)類似物(NUC)或干擾素治療；(2)合并其他病因?qū)е碌母螕p傷(如酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病)；(3)合并其他嗜肝病毒感染；(4)伴有肝硬化、肝癌或其他系統(tǒng)腫瘤；(5)使用免疫抑制劑。按照基線HBeAg水平分為HBeAg陰性組和HBeAg陽(yáng)性組。

1.2 觀察指標(biāo) 觀察HBeAg陽(yáng)性及HBeAg陰性患者在治療基線、1年、2年、3年各時(shí)間點(diǎn)的HBV DNA定量及HBsAg水平，分析其動(dòng)態(tài)變化情況，并比較兩組患者在上述時(shí)間點(diǎn)HBsAg水平分布情況。

1.3 檢測(cè)方法 采用熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBV DNA定量，使用羅氏公司全自動(dòng)AmpliPrep/COBAS TaqMan 48系統(tǒng)檢測(cè)儀及配套試劑，最低檢測(cè)下限為20 IU/mL；當(dāng)患者HBV DNA<20 IU/mL時(shí)，定義為HBV DNA檢測(cè)不到即陰轉(zhuǎn)，并按19 IU/mL來(lái)計(jì)算HBV DNA對(duì)數(shù)值；采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清HBV標(biāo)志物，使用美國(guó)雅培Architect i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑，HBsAg最低檢測(cè)下限為0.05 IU/mL。本院HBsAg定量檢測(cè)上限為25 000.00 IU/mL，即當(dāng)患者HBsAg>25 000.00 IU/mL時(shí)，均按照25 000.00 IU/mL錄入數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 基線特征 共納入CHB患者157例，年齡19～70歲，平均年齡(38.8±10.6)歲，男女比例1.09∶1。HBeAg陽(yáng)性患者73例(46.5%)，HBeAg陰性患者84例(53.5%)，其中包括1例治療前即為HBsAg陰性且高HBV DNA定量患者。HBeAg陽(yáng)性患者更年輕，HBV DNA定量及HBsAg水平顯著高于HBeAg陰性患者(P值均<0.001)。其他基線指標(biāo)兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 患者的基線特征

2.2 HBV DNA的動(dòng)態(tài)變化 HBeAg陽(yáng)性組基線HBV DNA定量為(5.7±2.3)log10IU/mL，HBeAg陰性組基線HBV DNA定量為(3.9±1.5)log10IU/mL。TDF抗病毒治療1年時(shí)，HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者的HBV DNA定量分別為(2.1±1.4)log10IU/mL和(1.5±0.5)log10IU/mL，HBV DNA轉(zhuǎn)陰率分別為65.8%和81.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.676，P<0.05)。TDF治療2年時(shí)，HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者的HBV DNA定量分別為(1.6±0.9)log10IU/mL和(1.3±0.2)log10IU/mL，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TDF治療3年，HBV DNA陰轉(zhuǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 各治療時(shí)間點(diǎn)上HBV DNA陰轉(zhuǎn)率

2.3 HBsAg的動(dòng)態(tài)變化 隨著TDF抗病毒時(shí)間的延長(zhǎng)，HBsAg水平在HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者中均呈下降趨勢(shì)，組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為26.850和8.096，P值均<0.001)。且在各時(shí)間點(diǎn)上，HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg水平顯著高于HBeAg陰性患者(F=25.456，P<0.001)(表2)。

對(duì)基線HBsAg水平進(jìn)行分層，不同基線HBsAg水平的HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者在TDF治療期間，HBsAg水平均呈現(xiàn)不斷下降趨勢(shì)(P值均<0.05)(表3、4)。

HBeAg陽(yáng)性患者在TDF治療過(guò)程中，中位HBsAg水平在第1年時(shí)下降1 856.5(158.4～12 103.1)IU/mL，第2年時(shí)下降879.8(130.5～2 382.5)IU/mL，第3年時(shí)下降479.9(95.0～1 662.4)IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.972，P<0.001)。HBeAg陰性患者在TDF治療過(guò)程中，中位HBsAg水平在第1年時(shí)下降130.3(-0.6～482.2)IU/mL，第2年時(shí)下降159.0(8.2～346.6)IU/mL，第3年時(shí)下降78.9(4.7～284.0)IU/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.513，P>0.05)。HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg水平下降顯著高于HBeAg陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.251，P<0.001)(圖2)。

圖2 HBsAg水平動(dòng)態(tài)變化

表2 各時(shí)間點(diǎn)HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者HBsAg水平

表3 不同基線HBsAg水平的HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg水平的3年動(dòng)態(tài)變化

表4 不同基線HBsAg水平的HBeAg陰性患者HBsAg水平的3年動(dòng)態(tài)變化

2.4 治療不同時(shí)間點(diǎn)HBsAg水平的分布情況 TDF治療過(guò)程中，HBsAg水平在<1500 IU/mL以內(nèi)的各區(qū)段累積百分比逐漸上升。TDF治療第1、2、3年，HBsAg的陰轉(zhuǎn)率分別為0.6%(1/157)、0.6%(1/157)、1.3%(2/157)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.504，P=0.777)。TDF治療第1、2、3年，HBsAg<100 IU/mL的患者占比分別為8.3%(13/157)、11.5%(18/157)、14.0%(22/157)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.594，P=0.273)。TDF治療第1、2、3年，HBsAg<1000 IU/mL的患者占比分別為32.5%(51/157)、40.1%(63/157)、45.2%(71/157)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.412，P=0.067)。TDF治療第1、2、3年，HBsAg<1500 IU/mL的患者占比分別為43.9%(69/157)、50.3%(79/157)、59.2%(93/157)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.410，P=0.025)。

TDF治療1、2、3年，HBeAg陰性患者HBsAg<100 IU/mL、<1000 IU/mL、<1500 IU/mL的患者比例均高于HBeAg陽(yáng)性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表5)。

表5 各時(shí)間點(diǎn)HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性不同區(qū)段HBsAg的患者分布

3 討論

根據(jù)目前關(guān)于TDF的臨床研究報(bào)道，其可強(qiáng)效持續(xù)抑制病毒復(fù)制，具有高耐藥屏障。本研究通過(guò)對(duì)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院157例使用TDF抗病毒治療的CHB患者進(jìn)行真實(shí)世界的回顧性分析，發(fā)現(xiàn)整體上患者的血清HBV DNA定量和HBsAg水平在TDF治療中呈逐漸下降趨勢(shì)，與既往研究[3-4]結(jié)果一致。但在HBeAg陽(yáng)性患者中，TDF治療3年有2.7%的患者尚未實(shí)現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn)，HBV DNA處于低水平復(fù)制狀態(tài)。既往有針對(duì)恩替卡韋(ETV)和TDF的真實(shí)世界研究[5]認(rèn)為無(wú)論HBeAg狀態(tài)如何，ETV和TDF治療的初治CHB患者完全病毒學(xué)應(yīng)答率通常在90%以上。隨著檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，HBV DNA檢測(cè)下限逐漸被突破，既往認(rèn)為“HBV DNA陰性”的部分患者被證實(shí)有低水平的HBV復(fù)制，這部分低病毒血癥(low-level viremia，LLV)狀態(tài)患者檢出率逐漸提高。LLV定義為抗病毒治療48周后可持續(xù)或間歇檢測(cè)到低水平的HBV DNA，即>檢測(cè)下限但<2000 IU/mL[6]，國(guó)內(nèi)認(rèn)為檢測(cè)下限為10 IU/mL或者20 IU/mL[7]，美國(guó)肝病學(xué)會(huì)制定的檢測(cè)下限為10 IU/mL[8]。有學(xué)者[9]認(rèn)為L(zhǎng)LV可能和NUC不能完全阻斷DNA鏈的合成有關(guān)。此外，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，近年來(lái)已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道TDF耐藥的現(xiàn)象，持續(xù)的病毒血癥可能與HBV耐藥相關(guān)突變、基線HBeAg陽(yáng)性狀態(tài)、初始高病毒定量等因素有關(guān)[11]。LLV狀態(tài)的CHB患者繼續(xù)原方案治療短期內(nèi)有病毒學(xué)突破和耐藥風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期存在肝病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[6]。對(duì)于這部分患者的管理，有專家建議治療過(guò)程中盡可能的提高患者依從性，定期行高靈敏度HBV DNA檢測(cè)，積極調(diào)整抗病毒治療方案，以獲得更高的完全病毒學(xué)應(yīng)答率及更好的長(zhǎng)期預(yù)后[7]。針對(duì)此類患者需排查是否存在不規(guī)范用藥，并考慮病毒基因型檢測(cè)、耐藥相關(guān)突變基因檢測(cè)以及更換抗病毒方案或者聯(lián)合抗病毒治療。

進(jìn)一步分析顯示，HBeAg陽(yáng)性患者相較HBeAg陰性患者年齡更輕，這與此前研究結(jié)果類似[12]，但不排除與研究樣本量較小有關(guān)，擬在后續(xù)研究中繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。HBeAg陽(yáng)性患者基線及各個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)上HBV DNA定量和HBsAg水平顯著高于HBeAg陰性患者，這可能與慢性HBV感染的自然史有關(guān)[13]。在慢性HBV感染中，HBeAg陽(yáng)性慢性感染期屬于早期階段，機(jī)體對(duì)病毒處于免疫耐受狀態(tài)(免疫耐受期)，表現(xiàn)為高HBV DNA定量和高HBsAg水平。隨著病毒不斷復(fù)制，宿主對(duì)病毒的免疫耐受狀態(tài)打破，免疫系統(tǒng)識(shí)別并攻擊HBV，進(jìn)入免疫清除期，HBsAg和HBV DNA水平逐漸下降，病程逐漸由HBeAg陽(yáng)性階段轉(zhuǎn)換為HBeAg陰性階段，進(jìn)入免疫控制期及HBeAg陰性肝炎期[14]。

本團(tuán)隊(duì)此前研究[4]發(fā)現(xiàn)，CHB患者使用ETV抗病毒治療，血清HBsAg水平的下降呈現(xiàn)出“快速下降期”和“緩慢下降期”兩個(gè)階段，本研究中僅在HBeAg陽(yáng)性患者中有類似發(fā)現(xiàn)。TDF治療中，HBeAg陽(yáng)性患者第1年HBsAg水平下降明顯快于第2年和第3年，可見(jiàn)HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg水平的下降呈現(xiàn)先快后慢；而在HBeAg陰性患者中HBsAg水平雖然整體上呈現(xiàn)逐漸下降，但前后下降速度無(wú)明顯變化。表明TDF和ETV在降低HBsAg方面并不一致，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。治療全程HBeAg陽(yáng)性患者HBsAg水平下降速度顯著快于HBeAg陰性患者，與Zoutendijk等[15]的研究結(jié)果相似。HBsAg的分泌機(jī)制或許可以解釋NUC治療過(guò)程中HBsAg下降呈現(xiàn)出的“先快后慢”的現(xiàn)象：血清HBsAg不僅來(lái)自具有轉(zhuǎn)錄活性cccDNA的信使RNA，而且還來(lái)源于整合的HBV DNA序列[16]。這些HBsAg或與病毒核衣殼結(jié)合以含有HBV DNA的病毒粒子包膜的形式分泌到血液循環(huán)中，或以無(wú)病毒核衣殼的空HBsAg亞病毒粒子的形式直接分泌到血液循環(huán)中。當(dāng)血清HBsAg水平很高時(shí)，相當(dāng)大比例的HBsAg可能來(lái)自含HBV DNA的病毒粒子[17]，在NUC治療期間，強(qiáng)效快速的抑制病毒復(fù)制將導(dǎo)致含有HBV DNA的病毒粒子急劇減少，繼而引起HBsAg快速減少，因此表現(xiàn)為T(mén)DF治療第一年，HBsAg水平下降速度最快。隨著時(shí)間的推移及病毒定量的降低，血清中HBsAg相對(duì)更多是來(lái)自cccDNA或整合的HBV DNA序列，以及空HBsAg顆粒的分泌，但這些途徑受NUC治療的影響很小[18]。這可以解釋本研究在隨后幾年的TDF治療中，HBsAg下降速度明顯放緩。

然而，作為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，即使ETV、TDF或富馬酸丙酚替諾福韋酯(TAF)等一線NUC，均不能直接抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，很難獲得HBsAg的清除[19]，本研究中使用TDF治療3年，僅有1例(1.2%)患者實(shí)現(xiàn)HBsAg清除。這就意味著為實(shí)現(xiàn)HBsAg清除而有必要另辟他徑，即與其他機(jī)制藥物聯(lián)合使用，如免疫制劑、干擾素等。近年來(lái)，慢性乙型肝炎臨床治愈(功能性治愈)專家共識(shí)[20]和指南[1]中，肯定了聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)在降低HBsAg和實(shí)現(xiàn)HBsAg清除方面的良好療效，并將HBsAg<1500 IU/mL作為PEG-IFNα治療的優(yōu)勢(shì)人群，對(duì)于獲得低HBsAg水平和低HBV DNA定量的NUC經(jīng)治患者，序貫或聯(lián)合PEG-IFNα可顯著增加HBsAg陰轉(zhuǎn)率和血清學(xué)轉(zhuǎn)換率。TDF治療3年，HBsAg<1500 IU/mL的HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者比例高達(dá)47.9%和69.0%，這為PEG-IFNα的使用帶來(lái)更多的潛在優(yōu)勢(shì)患者，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)臨床治愈[21-23]。

總之，TDF作為一線抗HBV藥物，治療期間HBV DNA定量和HBsAg水平均不斷下降，其療效值得肯定。CHB患者使用TDF治療3年，近一半患者可以達(dá)到HBsAg<1500 IU/mL從而成為未來(lái)臨床治愈的優(yōu)勢(shì)人群。對(duì)于長(zhǎng)期使用TDF但仍未獲得HBV DNA陰轉(zhuǎn)的患者需密切觀察。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年5月18日經(jīng)由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2020-922。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：魯瑞、李梅負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；劉晨瑞、劉怡欣、吳鳳萍、魯瑞、王怡愷參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；黨雙鎖、李梅負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。