陳現(xiàn)朝，廖祥政，高建剛，楊衛(wèi)兵，侯起嶺，劉江峰，張風(fēng)廷，張勝全

(北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所，北京 100097)

雜交小麥具有提高小麥產(chǎn)量的潛力。二系雜交小麥?zhǔn)抢霉鉁孛舨挥岛突謴?fù)系雜交，在產(chǎn)量、抗逆性等性狀上均優(yōu)于親本或?qū)φ掌贩N的雜交小麥品種。小麥雜交種往往需要外源小麥花粉進(jìn)行制種，自花授粉的小麥因制種親本花期不遇或株高差異等問(wèn)題，導(dǎo)致制種產(chǎn)量低且不穩(wěn)定。這是限制二系雜交小麥品種走向市場(chǎng)的主要因素之一。研究表明，制種親本抽穗期差異較大，是導(dǎo)致制種產(chǎn)量不穩(wěn)定的主要因素之一。研究遺傳和環(huán)境因素對(duì)二系雜交小麥親本抽穗期的作用，篩選抽穗期穩(wěn)定的材料并通過(guò)播期協(xié)調(diào)其發(fā)育進(jìn)程，對(duì)于穩(wěn)定二系雜交小麥的制種產(chǎn)量具有重要的意義。

與小麥抽穗期相關(guān)的基因有春化基因()、光周期基因()和早熟基因()。迄今為止，已有多個(gè)研究利用 PCR 擴(kuò)增技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)對(duì)春化基因、光周期基因在小麥中的組成和分布進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)春化基因和光周期基因在小麥抽穗期的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，春化基因和光周期基因的組成、分布與品種特性和生態(tài)區(qū)域相適應(yīng)；但部分研究因種植區(qū)域不同，基因效應(yīng)有所差異。Padovan等研究了基因、環(huán)境和播期對(duì)地中海地區(qū)硬粒小麥產(chǎn)量的作用，提出不同區(qū)域應(yīng)選擇適宜的品種及配套播期等栽培措施來(lái)提高產(chǎn)量。Kiss等通過(guò) 2011 年秋播和 2012 年春播，對(duì)不同播期的小麥抽穗期進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)小麥抽穗期與光周期基因相關(guān)，而春化基因?qū)π←湷樗肫诘淖饔貌伙@著。但春化基因?qū)Τ樗肫诘淖饔?，需在不同環(huán)境或多年試驗(yàn)條件下進(jìn)一步驗(yàn)證。2016年Rasheed等基于春化基因的STS標(biāo)記開(kāi)發(fā)了KASP標(biāo)記，并對(duì)國(guó)內(nèi)外小麥品種的分布及其對(duì)抽穗期的作用進(jìn)行了檢測(cè)。與STS標(biāo)記相比，KASP 標(biāo)記對(duì)基因組SNP 位點(diǎn)的變異檢測(cè)更為簡(jiǎn)便高效，且成本較低，因此成為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和篩選的主要技術(shù)手段。但利用KASP標(biāo)記對(duì)二系雜交小麥抽穗期穩(wěn)定性的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究以34份不育系和96份恢復(fù)系為試驗(yàn)材料，利用春化基因的7個(gè)KASP功能標(biāo)記，對(duì)其在不育系和恢復(fù)系的組成和分布進(jìn)行檢測(cè)。并于2018-2019和2019-2020兩個(gè)年度種植在河南鄧州，以播種至抽穗的日歷日和生長(zhǎng)度日為指標(biāo)，研究春化基因?qū)Χ惦s交小麥親本抽穗期的作用，分析攜帶不同等位基因親本的抽穗期穩(wěn)定性，以期獲得抽穗期穩(wěn)定的材料，為獲得制種產(chǎn)量穩(wěn)定的二系雜交小麥親本組合提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2018-2019和 2019-2020 兩個(gè)年度在北京市農(nóng)林科學(xué)院河南鄧州雜交小麥產(chǎn)業(yè)化試驗(yàn)基地(32.68°N，112.08°E)進(jìn)行。供試材料共 130 份，其中二系雜交小麥骨干光溫敏不育系 34 份(在鄧州地區(qū)常年10月25日播種，不育度大于95%)，骨干恢復(fù)系 96 份(其中12份為外部引進(jìn)品種，84份為本研究所改良的高恢復(fù)力材料)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)及表型調(diào)查

2018年和2019年，34份不育系分別于10月13日和10月19日播種，96份恢復(fù)系分別于10月19日和10月27日播種。每個(gè)材料種植2行，每行30粒，行長(zhǎng)1.5 m，行距25 cm。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2個(gè)重復(fù)。施用小麥專用復(fù)合肥(N∶P∶K為 25∶14∶7)，化肥全部基施，按照一般大田管理技術(shù)進(jìn)行管理。參照宋彥霞等的方法對(duì)抽穗期進(jìn)行田間調(diào)查。播種至抽穗的日期為抽穗期的日歷日。

1.2.2 春化基因的檢測(cè)

參考Rasheed等報(bào)道的7個(gè)KASP標(biāo)記(Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_ Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A)對(duì)春化基因進(jìn)行檢測(cè)。具體引物序列信息如表1所示。根據(jù)KASP技術(shù)的要求，F(xiàn)AM引物5′端加上特異性接頭GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX引物5′端加上特異性接頭GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。于小麥返青期，剪取小麥葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA，濃度在10～30 ng·μL之間。以基因組DNA為模板，分別用7對(duì)KASP標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)5 μL，ddHO 3.6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火(選用Touchdown程序，每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃)1 min，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃延伸 1 min，繼續(xù)擴(kuò)增26個(gè)循環(huán)。待PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溫度降至40 ℃ 以下時(shí)，通過(guò)酶標(biāo)儀FAM、HEX光束掃描讀取熒光值，用LGC公司開(kāi)發(fā)的SNP viewer 2.0軟件讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果剔除雜合和缺失位點(diǎn)樣本，用Excel統(tǒng)計(jì)不育系和恢復(fù)系材料中、和位點(diǎn)等位基因的分布頻率。

表1 檢測(cè) Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1等位基因所用的引物信息

1.2.3 溫度信息的采集

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1的組成及分布

結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，供試材料以冬性材料為主。7個(gè)標(biāo)記 Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A在供試材料中主要檢測(cè)到5個(gè)等位基因。除了未檢測(cè)出目的條帶的材料外，、2147 type、、Hereward-type 是不育系和恢復(fù)系中的主要等位基因類型，分布頻率分別為 88.24%和84.38%、44.12%和54.17%、88.24%和28.13%、82.35%和 92.70%；是不育系和恢復(fù)系中的主要等位基因類型，分布頻率分別為 52.94% 和 61.45%。由表3可知，供試材料包含39種春化基因型，其中1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、18號(hào)基因型在不育系和恢復(fù)系均存在，分別占不育系和恢復(fù)系的76.48%和46.87%。

表2 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1基因在不育系和恢復(fù)系中的組成和分布頻率

2.2 播期和春化基因 Vrn-1對(duì)二系雜交小麥親本抽穗期的影響

由表3可知，1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)四個(gè)基因型在供試材料中的分布頻率較大。因此，本研究以1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)四個(gè)基因型的不育系和恢復(fù)系為研究對(duì)象，以播種至抽穗的日歷日和生長(zhǎng)度日為指標(biāo)，研究播期和春化基因?qū)Σ挥岛突謴?fù)系抽穗期的作用。對(duì)供試材料2018-2019和2019-2020兩個(gè)年度播種至抽穗的日歷日和生長(zhǎng)度日進(jìn)行顯著性比較分析，從表4 可以看出，兩個(gè)年度不育系和恢復(fù)系間播種至抽穗的生長(zhǎng)度日差異均達(dá)到極顯著水平，但播種至抽穗的日歷日因年度變化而不同；其中2018-2019年度不育系和恢復(fù)系間差異極顯著，2019-2020年差異不顯著。

表3 Vrn-A1、 Vrn-B1 和 Vrn-D1 基因型的組成和分布頻率

表4 不育系和恢復(fù)系播種至抽穗的日歷日和生長(zhǎng)度日顯著性比較

為進(jìn)一步闡明不同基因型親本的抽穗期穩(wěn)定性，選擇1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)四個(gè)基因型的不育系和恢復(fù)系為材料，在2018-2019和2019-2020兩個(gè)年度對(duì)不育系和恢復(fù)系組合間播種至抽穗的日歷日和生長(zhǎng)度日進(jìn)行顯著性比較分析，結(jié)果(表 5)表明，1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)四個(gè)基因型的不育系和恢復(fù)系組合間播種至抽穗的日歷日差值和生長(zhǎng)度日差值因組合不同而表現(xiàn)不同。且不育系和恢復(fù)系在不同組合間和不同年度間播種至抽穗的日歷日差值不穩(wěn)定。對(duì)不育系和恢復(fù)系組合間生長(zhǎng)度日差值而言，組合“3號(hào)×3號(hào)”、“3號(hào)×4號(hào)”在兩個(gè)年度間的穩(wěn)定性較好，2018-2019和 2019-2020兩個(gè)年度播種至抽穗的生長(zhǎng)度日差值分別為-96.3和-90.3 ℃·d、-118.9和-122.0 ℃·d，差異達(dá)極顯著水平；組合“5號(hào)×4號(hào)”在兩個(gè)年度播種至抽穗的生長(zhǎng)度日差值穩(wěn)定性最差，2018-2019和 2019-2020兩個(gè)年度分別為-110.7和-84.0 ℃·d，差異達(dá)極顯著和顯著水平。

表5 不育系和恢復(fù)系不同基因型組合播種至抽穗的日歷日差異和生長(zhǎng)度日差異

3 討 論

3.1 小麥春化基因 Vrn-1的組成和分布

明確二系雜交小麥親本春化基因的組成和分布，可為其在制種產(chǎn)量穩(wěn)定性方面奠定基礎(chǔ)。Zhang等對(duì)春化基因、、和在不同麥區(qū)的組成及分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)顯性等位基因的分布頻率自北向南逐漸增加，其中在黃淮冬麥區(qū)的分布頻率為36.1%，而在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)和西南麥區(qū)的分布頻率為64.1%，且僅含有春化顯性等位基因；隱性等位基因在華北平原冬麥區(qū)的分布頻率為100%，在黃淮麥區(qū)也有分布。本研究結(jié)果表明，二系雜交小麥骨干親本春化基因以顯性基因型為主，占比80%以上，該結(jié)果比Zhang等的研究結(jié)果(53.0%)有所提高，這可能與材料來(lái)源不同有關(guān)。本研究供試材料群體春化基因變異較少，且主效等位基因幾乎無(wú)變異。這可能與二系雜交小麥不育系在北京(可育)、鄧州(不育)兩地進(jìn)行穿梭育種有關(guān)，供試材料經(jīng)過(guò)人工定向選育和兩種自然環(huán)境雙重選擇壓力，群體春化基因變異較小。

3.2 小麥春化基因 Vrn-1在小麥抽穗期的作用

小麥發(fā)育既受春化和光周期基因調(diào)控，也受光照和溫度影響。Zhang等發(fā)現(xiàn)，攜帶的小麥材料抽穗期最早，攜帶和的材料次之。本研究供試材料不育系和恢復(fù)系組合“3號(hào)×4號(hào)”在2018-2019和2019-2020兩個(gè)年度中的穩(wěn)定性較好，原因可能是組合“3號(hào)×4號(hào)”在和位點(diǎn)的等位基因存在差異，而在位點(diǎn)上相同。因此，為篩選抽穗期穩(wěn)定的小麥，應(yīng)進(jìn)一步通過(guò)分子標(biāo)記輔助鑒定并篩選不育系和恢復(fù)系春化基因型組合“3號(hào)×4號(hào)”的小麥進(jìn)行制種。

此外，由于本研究?jī)H基于基因的KASP標(biāo)記對(duì)二系雜交小麥親本抽穗期的作用進(jìn)行研究。未能分析其他春化基因、光周期基因或早熟基因?qū)Χ惦s交小麥親本抽穗期的作用。因此，下一步應(yīng)結(jié)合STS標(biāo)記研究其他春化基因(如)和光周期基因的等位基因組合對(duì)二系雜交小麥親本抽穗期的作用。

3.3 抽穗期與生長(zhǎng)度日的關(guān)系

小麥生長(zhǎng)發(fā)育需要的積溫相對(duì)穩(wěn)定，但由于年度間或不同播期小麥發(fā)育進(jìn)程溫度變化不穩(wěn)定和光照時(shí)長(zhǎng)的差異，以小麥播種至抽穗的日歷日為小麥發(fā)育進(jìn)程的指標(biāo)不夠準(zhǔn)確。本研究比較攜帶不同春化基因型的小麥播種至抽穗的日歷日差異和生長(zhǎng)度日差異，發(fā)現(xiàn)攜帶相同春化基因型的小麥播種至抽穗的生長(zhǎng)度日較日歷日更穩(wěn)定。同時(shí)，由于小麥發(fā)育階段的基礎(chǔ)溫度因品種或發(fā)育階段有所不同，本研究利用0 ℃作為小麥播種至抽穗的基礎(chǔ)溫度不夠準(zhǔn)確，導(dǎo)致不同基因型小麥播種至抽穗的生長(zhǎng)度日在年度間有所變動(dòng)。

綜上所述，以小麥生長(zhǎng)度日為播種至抽穗的指標(biāo)，以春化基因的KASP功能標(biāo)記輔助篩選到不育系和恢復(fù)系春化基因型組合為“3號(hào)×4號(hào)”且抽穗期穩(wěn)定的材料，并結(jié)合鄧州地區(qū)光溫特性調(diào)整播期以協(xié)調(diào)其發(fā)育進(jìn)程，為穩(wěn)定并提高二系雜交小麥制種產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。