高祖鵬, 靜大鵬, 黃曉丹,2, 王振營(yíng),*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193;2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究所, 天敵昆蟲(chóng)應(yīng)用技術(shù)工程研究中心, 長(zhǎng)春 130118)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有遷飛能力強(qiáng)、寄主植物廣、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)(郭井菲等, 2018, 2019a)。近年來(lái)隨著國(guó)際貿(mào)易量的增加與人員頻繁的流動(dòng)為草地貪夜蛾從美洲大陸入侵非洲等洲提供了便利的途徑，目前已逐漸蔓延至非洲、亞洲和大洋洲等國(guó)家和地區(qū)(CABI, 2019; Jingetal., 2020)。草地貪夜蛾于2019年1月初在我國(guó)云南省普洱市江城縣首次被發(fā)現(xiàn)后，并迅速向周邊地區(qū)和省份擴(kuò)散為害，截止至2020年7月9日其已蔓延至我國(guó)21個(gè)省(市、區(qū))1 029縣(區(qū))，已經(jīng)對(duì)我國(guó)糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅(郭井菲等, 2019b; 王磊和陸永躍, 2020)?；瘜W(xué)防治具有見(jiàn)效快、效果好、殺蟲(chóng)譜廣等特點(diǎn)，尤其在害蟲(chóng)暴發(fā)期間的應(yīng)急防控中的作用更加明顯。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后在2019和2020年推薦了用于草地貪夜蛾應(yīng)急防治的藥劑，最終確定并推薦了防治效果好的包括乙基多殺菌素在內(nèi)的8種化學(xué)農(nóng)藥(梁沛等, 2020; Gaoetal., 2021)。而乙基多殺菌素作為多殺菌素的衍生品與多殺菌素類(lèi)殺蟲(chóng)劑一樣具有相同的作用靶標(biāo)，即煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors, nAchRs)(Salgado, 1998)。

煙堿型乙酰膽堿受體是由5個(gè)亞基對(duì)稱排列而成是一種五聚體跨膜蛋白，其中包括了離子通道、激動(dòng)劑/競(jìng)爭(zhēng)性接抗性結(jié)合位點(diǎn)、具有調(diào)節(jié)離子通道功能的偶聯(lián)機(jī)制、4個(gè)跨膜區(qū)(Badio and Daly, 1994; Corringer and Nicolas, 2000; Millar and Denholm, 2007)。根據(jù)胞內(nèi)N端是否存在兩個(gè)相連的半胱氨酸結(jié)構(gòu)來(lái)判斷nAchR家族：若存在，則為α亞基家族；反之，則為β亞基家族。近年來(lái)隨著昆蟲(chóng)基因組測(cè)序的不斷增加，根據(jù)已知昆蟲(chóng)的基因組序列，已發(fā)掘眾多昆蟲(chóng)的煙堿型乙酰膽堿受體基因，其中包含了鱗翅目、膜翅目、半翅目以及鞘翅目等重要農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)。其中膜翅目的麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis具有昆蟲(chóng)中最多的nAchR亞基類(lèi)型，總共發(fā)現(xiàn)了16個(gè)nAchR亞基類(lèi)型(Huangetal., 1999, 2000)。相反，脊椎動(dòng)物的nAchR亞基家族要大得多，目前報(bào)告最多的為紅鰭東方豚Fugurubripes，共計(jì)有27個(gè)亞基(Jonesetal., 2003)。此外，昆蟲(chóng)的nAchRs與脊椎動(dòng)物的nAchRs相比，其主要分布在神經(jīng)突觸的前膜與后膜，與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與傳遞有關(guān)(Le Novèreetal., 2002)，因此備受眾多農(nóng)藥研發(fā)者的關(guān)注。

nAchRs在昆蟲(chóng)神經(jīng)遞質(zhì)傳達(dá)中起著重要作用，是多殺菌素殺蟲(chóng)劑的重要靶標(biāo)，但是目前對(duì)草地貪夜蛾nAchRs分子特性、功能及調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，且在基因組中對(duì)此基因未有注釋。本研究基于前期已測(cè)得的草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出在乙基多殺菌素處理下差異表達(dá)的nAchR α6和α7亞基基因，采用RT-PCR以及RACE技術(shù)對(duì)nAchR α6和α7亞基基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，同時(shí)通過(guò)RT-qPCR技術(shù)分析草地貪夜蛾幼蟲(chóng)受到乙基多殺菌素脅迫后nAchR亞基α6和α7基因表達(dá)量的變化，可為后期研究草地貪夜蛾nAchR基因的功能及草地貪夜蛾抗藥性的產(chǎn)生提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

草地貪夜蛾初始種群于2019年1月采集于云南省德宏州芒市(24.42° N, 98.60° E)冬玉米田，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米害蟲(chóng)組于人工氣候箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，MGC-450HP-2)(溫度26±1℃，相對(duì)濕度65%±5%，光周期14L∶10D)內(nèi)飼養(yǎng)，利用夜蛾科通用人工飼料飼養(yǎng)(梁革梅等, 1999)，飼養(yǎng)期間不接觸任何農(nóng)藥試劑。取飼養(yǎng)至F3代的幼蟲(chóng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

乙基多殺菌素原藥，由科迪華農(nóng)業(yè)科技(上海)有限公司提供；二甲基亞砜(DMSO)、TRIzol?Reagent、丙醇和異丙酮，均購(gòu)于北京星弦科技有限公司；TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Syethesis SuperMix試劑盒與LanGene?2×Fastlong PCR MasterMix，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)于北京天漠生物科技有限公司；5′RACE試劑盒與3′RACE 試劑盒，均購(gòu)于北京天恩澤基因科技有限公司；Pfu DNA聚合酶，購(gòu)于Zoonbio公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)，購(gòu)置于寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 總RNA的提取與cDNA合成

從草地貪夜蛾實(shí)驗(yàn)室品系中隨機(jī)挑選3頭3齡幼蟲(chóng)，采用TRIzol法提取總RNA，參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Syethesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第1鏈，并放置于-80℃保存。

1.4 草地貪夜蛾nAchR α6和α7亞基基因克隆

本研究前期通過(guò)Blast等技術(shù)比對(duì)草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定得到草地貪夜蛾nAchR α6和α7亞基基因編碼區(qū)序列，基于亞基α6的完整開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，設(shè)計(jì)引物(表1)nAchRsα6-F/R，對(duì)其序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序并驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增體系(40 μL): LanGene?2×Fastlong PCR MasterMix 20 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各2 μL, cDNA 4 μL, PCR-Grad H2O 12 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 54℃退火40 s, 72℃延伸120 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6 min，4℃保存。

采用RACE克隆技術(shù)獲得亞基α7基因全長(zhǎng)序列。擴(kuò)增體系與實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照5′RACE 試劑盒與3′RACE 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)所用引物(表1)及測(cè)序工作均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

利用DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行堿基序列拼接及氨基酸序列推導(dǎo)。利用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/)查找開(kāi)放閱讀框以及推測(cè)的氨基酸序列，并確認(rèn)和DNAMAN的預(yù)測(cè)一致。通過(guò)NCBI-Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索18個(gè)物種的nAchRs的同源氨基酸序列，總計(jì)81個(gè)氨基酸序列，并用MEGA5.1軟件中的鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)運(yùn)行1 000次。

1.6 乙基多殺菌素脅迫后草地貪夜蛾幼蟲(chóng)nAchR α6和α7亞基基因表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期毒力測(cè)定，首先將乙基多殺菌素原藥用DMSO試劑溶解，后用含0.1% Tween-80蒸餾水稀釋成0.400 mg/L的乙基多殺菌素溶劑(高祖鵬等, 2020)，采用表面涂抹法處理草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)；以0.1%的Tween-80蒸餾水處理為對(duì)照組。處理48 h后選取存活的處理組和對(duì)照組幼蟲(chóng)各取3頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。根據(jù)1.4節(jié)獲得得到的草地貪夜蛾nAchR α6和α7亞基基因序列，利用Primer 3.0(https:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，同時(shí)以草地貪夜蛾ribosomal protein S23 mRNA(GenBank登錄號(hào): AF400219.1)為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)(表1)。依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。qPCR反應(yīng)體系: 5×UEIris II RT MasterMix 4 μL, dsDNase 1 μL, cDNA 1 μL, Nuclease-free H2O 13 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。qPCR反應(yīng)程序: 95℃ 10 s; 95℃ 3 s, 60℃ 30 s; 95℃ 15 s, 共40個(gè)循環(huán)。處理組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)均采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCT方法對(duì)草地貪夜蛾 nAchR α6和α7亞基基因的表達(dá)量進(jìn)行分析(Mulleretal., 2002)。將Cq值采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 nAchR α6和α7亞基基因克隆和序列

克隆獲得草地貪夜蛾nAchR α6亞基基因(GenBank登錄號(hào): MT951400)，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 506 bp，編碼502個(gè)氨基酸，并具有跨膜區(qū)域與信號(hào)肽，與甜菜夜蛾Spodopteraexigua的nAchR α6 isoform 3b8a(GenBank登錄號(hào): QIC53910.1)具有99.79%的氨基酸序列一致性。nAchR α7亞基基因(GenBank登錄號(hào): MW557608)開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 524 bp，編碼508個(gè)氨基酸，并具有跨膜區(qū)與信號(hào)肽，與棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmieran nAchR α7亞基基因(GenBank：AJF23047.1)的氨基酸序列一致性97.24%。草地貪夜蛾的nAchR亞基α6和α7在胞內(nèi)環(huán)具有半胱氨酸環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)，但是麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis不存在該特征序列；且nAchR亞基α6和α7存在連續(xù)的12個(gè)氨基酸(RSSKSLLANVLD)，其中，第212和213位氨基酸為雙C結(jié)構(gòu)并具有4個(gè)跨膜區(qū)。由此可以看出草地貪夜蛾nAchR亞基α6和α7具有典型的煙堿性乙酰膽堿受體α家族的典型特征。

2.2 nAchR亞基α6與α7 系統(tǒng)發(fā)育

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與遺傳距離分析結(jié)果可知，草地貪夜蛾nAchR亞基α6氨基酸序列與甜菜夜蛾的nAchR α6親緣性較近；草地貪夜蛾nAchR亞基α7與棉鈴蟲(chóng)的nAchR α7親緣性較近(圖2)。此外，各昆蟲(chóng)的nAchR亞基α6與α7之間具有較近的同源性(圖2)。

2.3 乙基多殺菌素對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)nAchR α6與α7亞基基因相對(duì)表達(dá)量的影響

草地貪夜蛾幼蟲(chóng)取食含有乙基多殺菌素(0.400 mg/L)的飼料后，其體內(nèi)nAchR α6亞基基因表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)(P<0.05)，為對(duì)照的2.22倍(圖3: A)；而nAchR α7亞基基因表達(dá)量與對(duì)照相比表達(dá)量雖有上調(diào)，但未達(dá)到顯著差異(圖3: B)。

3 討論

本研究根據(jù)草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR與RACE的方法，從草地貪夜蛾中經(jīng)過(guò)篩選并克隆出了2個(gè)nAchR α6和α7亞基基因全長(zhǎng)序列。結(jié)構(gòu)域推斷具有典型的nAchRs α亞基家族的基因特征(圖1)。根據(jù)同源性比較發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾nAchR亞基α6同甜菜夜蛾nAchR亞基α6具有較高的同源性；草地貪夜蛾nAchR亞基α7同棉鈴蟲(chóng)nAchR亞基α7具有較高的同源性。此外，根據(jù)秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans基因組序列，發(fā)現(xiàn)至少存在27個(gè)亞基，某些亞基在神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中都存在，而且存在于突觸和非突觸位點(diǎn)上(Jones and Sattelle, 2004)。這也可能預(yù)示著昆蟲(chóng)可能同線蟲(chóng)一樣，具有豐富的nAchR亞基類(lèi)型，這也為后續(xù)深入了解草地貪夜蛾煙堿性乙酰膽堿受體的類(lèi)型奠定基礎(chǔ)。隨著昆蟲(chóng)nAchR亞基研究的日漸深入，同時(shí)也出現(xiàn)了眾多問(wèn)題。例如昆蟲(chóng)nAchR存在命名混亂的可能性。我們根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析得出，部分昆蟲(chóng)的nAchR α9, nAchR α10, nAchR β2與nAchR β3亞基被劃分為同一類(lèi)，表現(xiàn)出昆蟲(chóng)nAchRs的命名較為混亂。同樣地，在家蠶nAchR亞基α8與黑腹果蠅nAchR亞基β2也表現(xiàn)出了較高的同源性。這可能跟昆蟲(chóng)nAchR亞基的命名方式是根據(jù)同屬昆蟲(chóng)nAchR亞基而命名有關(guān)，如蚜蟲(chóng)的α1和α2亞基則是采用桃蚜Myzuspersicae的α1和α2的命名方式命名(Puineanetal., 2013)(圖2)。

昆蟲(chóng)煙堿型乙酰膽堿受體是昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，因此基于該受體研發(fā)了一系列作用于煙堿型乙酰膽堿受體的殺蟲(chóng)劑，如沙蠶毒素類(lèi)、多殺菌素類(lèi)、煙堿類(lèi)和新煙堿類(lèi)等殺蟲(chóng)劑(Matsudaetal., 2001; Tomizawaetal., 2003)。乙基多殺菌素作為一種多殺菌素類(lèi)殺蟲(chóng)劑，其與多殺菌素一樣具有相同的作用方式。根據(jù)電生理學(xué)檢測(cè)多發(fā)現(xiàn)，多殺菌素類(lèi)殺蟲(chóng)劑通常與煙堿型乙酰膽堿受體相結(jié)合，使昆蟲(chóng)的nAchRs產(chǎn)生異常的生物學(xué)信號(hào)，誘使昆蟲(chóng)肌肉產(chǎn)生持續(xù)異常的生理行為，最終昆蟲(chóng)因自身能量的大量消耗而死亡(Salgado, 1998)。本研究初步分析了乙基多殺菌素對(duì)草地貪夜蛾的作用機(jī)理，結(jié)果表明在乙基多殺菌素脅迫下，草地貪夜蛾煙堿型乙酰膽堿受體亞基基因均有不同程度的表達(dá)，其中nAchR亞基α6基因在乙基多殺菌素脅迫下表達(dá)量顯著性增加，而nAchR α7亞基基因的表達(dá)量無(wú)顯著性變化(圖3)，由此初步判斷乙基多殺菌素作用于草地貪夜蛾的nAchR亞基α6。而謝丙堂等(2015)的研究表明乙基多殺菌素處理棉鈴蟲(chóng)72 h后，nAchR α7亞基基因表達(dá)量被誘導(dǎo)，而且高劑量誘導(dǎo)作用明顯，差異顯著。這一結(jié)果與我們的研究結(jié)果正好相反，這說(shuō)明乙基多殺菌素對(duì)不同昆蟲(chóng)的作用靶標(biāo)位點(diǎn)具差異性。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸應(yīng)用于農(nóng)藥毒理學(xué)研究。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9敲除nAchR增加了甜菜夜蛾、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella與棉鈴蟲(chóng)對(duì)多殺菌素與乙基多殺菌素的敏感性(Wang Jetal., 2020; Wang XLetal., 2020; Zuoetal., 2020)。謝丙堂(2015)與Wang J等(2020)發(fā)現(xiàn)分別采用qPCR技術(shù)與CRISPR/Cas9技術(shù)驗(yàn)證乙基多殺菌素對(duì)棉鈴蟲(chóng)的作用靶標(biāo)時(shí)，前者發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素作用于棉鈴蟲(chóng)nAchR α7，而后者發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素作用于棉鈴蟲(chóng)nAchR α6，二者結(jié)果具有一定差異性。此差異性的出現(xiàn)可能與二者的實(shí)驗(yàn)技術(shù)相關(guān)。但是CRISPR/Cas9技術(shù)同其他定向基因組編輯技術(shù)一樣，需要滿足基因序列及結(jié)構(gòu)已知的條件(張婷婷等, 2015)。因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的草地貪夜蛾nAchR亞基α6與α7的基因序列，可為后期采用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)一步探究乙基多殺菌素對(duì)草地貪夜蛾的作用機(jī)理奠定了初步基礎(chǔ)。