吳 帥, 顧 希, 肖彩云, 李 明, 李榮玉,*, 廖 遜,*

(1. 貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所, 貴陽 550025; 2. 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室, 貴陽 550025;3. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025)

褐飛虱Nilaparvatalugens屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，具有單食性及遷飛性等特點(Dyck and Thoma, 1979; 洪曉月和丁錦華, 2007)，是為害亞洲水稻生產(chǎn)的主要害蟲之一，每年對我國稻區(qū)造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失(程家安和祝增榮, 2006)。該害蟲通過刺吸式口器刺穿水稻莖稈取食汁液，從而阻斷維管束組織，影響營養(yǎng)傳輸導(dǎo)致水稻大面積倒伏枯死，同時還可作為水稻病毒的傳播媒介對水稻造成間接危害。目前褐飛虱的防治措施以化學(xué)防治為主，但長期大規(guī)模單一使用化學(xué)藥劑已經(jīng)導(dǎo)致褐飛虱對許多殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(李榮玉等, 2016; Zhangetal., 2016; Wuetal., 2018; Liaoetal., 2021)。因此，了解褐飛虱的抗性水平，對于田間褐飛虱的合理選藥和用藥具有重要的參考價值。

目前室內(nèi)測定褐飛虱對殺蟲劑的抗性水平主要采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻褐飛虱抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(NY/T1708-2009)中的稻莖浸漬法和稻苗浸漬法。該方法所得結(jié)果雖然準(zhǔn)確性高，但存在試驗步驟復(fù)雜、費(fèi)時、費(fèi)力等問題，故不適用于在田間快速檢測褐飛虱的抗性水平。因此，需要開發(fā)一種簡單、快速的田間褐飛虱抗藥性水平檢測方法?；诓Ａ克幠しǐ@得的殺蟲劑診斷劑量，可用于開發(fā)快速測定昆蟲對殺蟲劑抗性水平的選藥試劑盒(張宗磊, 2013; 高希武等, 2014; 郭靜靜等, 2017)。本研究參考玻璃瓶藥膜法建立了一種抗藥性快速檢測方法，該方法操作簡單，且適用于稻飛虱這種個體較小昆蟲的抗性水平檢測。

新煙堿類藥劑是作用于昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的一類高效殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防治蚜蟲(Devineetal., 2016)、煙粉虱Bemisiatabaci(Basitetal., 2011)、稻飛虱(何佳春等, 2019)等刺吸式口器害蟲。但是隨著新煙堿類藥劑的長期使用，我國褐飛虱田間種群對多種新煙堿類藥劑產(chǎn)生了抗性，如對第一代新煙堿類藥劑吡蟲啉已經(jīng)產(chǎn)生了高水平抗性(劉敘桿等, 2010; 王鵬等, 2013; Garroodetal., 2016)，對第二代新煙堿類藥劑噻蟲嗪和烯啶蟲胺等也產(chǎn)生了中等至高水平抗性(Zhangetal., 2014; Shunetal., 2018)；此外相關(guān)學(xué)者也監(jiān)測到褐飛虱對異丙威及毒死蜱的抗性水平為低水平至中等水平抗性(廖遜, 2019; 張帥, 2019)。隨著褐飛虱抗藥性水平的不斷上升，往往需要施用更高劑量的殺蟲劑才能保證有效的防控，但這也會導(dǎo)致褐飛虱抗性個體頻率的增加，從而導(dǎo)致殺蟲劑面臨防治失效的風(fēng)險。

為實現(xiàn)快速檢測田間褐飛虱種群對部分新煙堿類殺蟲劑以及毒死蜱、醚菊酯和異丙威的抗性水平，本研究通過玻璃瓶藥膜法，建立了褐飛虱對2種新煙堿類殺蟲劑以及毒死蜱、醚菊酯和異丙威敏感性的診斷劑量，采用所確定的診斷劑量，測定了5個褐飛虱田間種群對這5種殺蟲劑的抗性水平，并與稻苗浸漬法測得的抗性倍數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，對采用診斷劑量所測得的褐飛虱抗性倍數(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗證。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

室內(nèi)褐飛虱敏感種群(SS)：于2006年采自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田，不接觸任何藥劑室飼養(yǎng)至今(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈)。

貴州省田間褐飛虱種群：花溪種群(HX)、惠水種群(HS)、黃平種群(HP)、安順種群(AS)、湄潭種群(MT)分別于2020年8-9月采自貴州省花溪、惠水、黃平、安順和湄潭地區(qū)的田間水稻上；安龍種群(AL)于2021年9月采于貴州省安龍地區(qū)的水稻上。

所有褐飛虱種群均在不接觸任何藥劑的新鮮水稻苗上飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 供試藥劑及儀器

95.8%吡蟲啉原藥、95%醚菊酯原藥、98%毒死蜱原藥和97.3%異丙威原藥，湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司；98%啶蟲脒原藥，山東聯(lián)合化工有限公司；丙酮，山東化工有限公司；滾軸混勻儀，杭州米歐儀器有限公司。

1.3 殺蟲劑對褐飛虱的毒力測定

1.3.1玻璃瓶藥膜法：參考郭靜靜等(2017)的方法稍加修改，用丙酮將5種供試藥劑原藥配制成母液，試驗時根據(jù)藥劑初篩結(jié)果再按等差或等比用丙酮稀釋成所需濃度。從稀釋好的藥液中吸取350 μL滴入內(nèi)徑2.3 cm、高4.3 cm(內(nèi)表面積為35.20 cm2)的玻璃瓶中，將玻璃瓶放在滾軸混勻儀上滾動30 min，使藥液均勻覆蓋玻璃瓶內(nèi)壁，待丙酮揮發(fā)干后進(jìn)行測定。每種藥劑設(shè)5～6個濃度，每濃度3次重復(fù)，僅添加丙酮作為對照。使用吸蟲器將15頭健康一致褐飛虱3齡若蟲放入藥瓶中，輕輕蓋上瓶蓋(確?？諝饪蛇M(jìn)入瓶中且試蟲無法逃逸)，將玻璃瓶放入溫度27±1℃、相對濕度70%～80%的人工氣候箱中(設(shè)置為全光照)，1 h后檢查死亡率。以對照死亡率小于10%為有效測定，并用對照死亡率進(jìn)行校正。

1.3.2稻苗浸漬法：采用稻苗浸漬法(Liaoetal., 2017)測定室內(nèi)褐飛虱敏感種群和貴州省田間種群對吡蟲啉、啶蟲脒、醚菊酯、毒死蜱和異丙威5種殺蟲劑的敏感性。將稱取的原藥用丙酮溶液稀釋得到一定濃度的母液，根據(jù)藥劑初篩結(jié)果用含0.1% Triton-X 100(Sigma-Aldrich)的蒸餾水按等比或等差把母液稀釋成5個濃度梯度的藥液用于浸苗。取室內(nèi)培養(yǎng)的長10 cm左右的帶根稻苗，沖洗根部直至沒有過多雜質(zhì)，每15根稻苗為1個重復(fù)，每個濃度3個重復(fù)。洗凈后的稻苗放置陰干至表面無水痕后置于藥液中浸漬30 s，按藥液濃度由低到高的順序處理，以含0.1% Triton-X 100的蒸餾水為對照，取出后晾干稻苗表面藥液，待藥液晾干后以浸濕的脫脂棉裹住稻苗莖基部以下使得根部不外露，包好的稻苗放入含有30～35 mL營養(yǎng)液的杯子中，以防止稻苗在試驗時間內(nèi)枯萎從而造成實驗誤差。吸取褐飛虱3齡若蟲，將試蟲小心移入有稻苗的杯中，用棉紗布和橡皮筋封住杯口，防止試蟲爬出。每杯15頭若蟲為1個重復(fù)，每個濃度3個重復(fù)，總蟲數(shù)45頭，將培養(yǎng)杯放入溫度27±1℃、相對濕度70%～80%、光周期16L∶8D的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h(異丙威、毒死蜱和醚菊酯)和96 h(啶蟲脒和吡蟲啉)后記錄試蟲死亡數(shù)。

1.4 診斷劑量的測定

采用玻璃瓶藥膜法進(jìn)行生物活性測定，并利用毒力回歸方程分別計算5種殺蟲劑對室內(nèi)褐飛虱敏感種群的LD90值。分別制備5種殺蟲劑相應(yīng)LD90劑量下的載藥玻璃瓶(含相應(yīng)劑量藥膜)，并測定其對室內(nèi)褐飛虱敏感種群的實際死亡率，從而驗證上述LD90值的準(zhǔn)確性。目前已有文獻(xiàn)報道采用LD90或LD99劑量作為診斷劑量(張宗磊, 2013; 郭靜靜等, 2017)，本研究對計算獲得的LD90進(jìn)行準(zhǔn)確性驗證，若LD90劑量下褐飛虱敏感種群實際死亡率在85%～95%之間，則該LD90劑量將作為殺蟲劑的診斷劑量用于制備相應(yīng)的快速檢測試劑盒。

1.5 診斷劑量檢測方法的準(zhǔn)確性驗證

采用玻璃瓶藥膜法分別測定褐飛虱室內(nèi)敏感種群以及2020年采自貴州省花溪、惠水、黃平、安順和湄潭地區(qū)的5個田間種群在5種殺蟲劑診斷劑量下的校正死亡率，將死亡率與稻苗浸漬法測得的抗性倍數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，評價通過該診斷劑量快速測定褐飛虱抗性水平的可行性。同時，利用玻璃瓶藥膜法實測死亡率與稻苗浸漬法實測抗性倍數(shù)兩組數(shù)據(jù)構(gòu)建回歸方程模型。

采用玻璃瓶藥膜法測定2021年采自貴州省安龍縣褐飛虱田間種群在5種殺蟲劑診斷劑量下的校正死亡率，將死亡率數(shù)據(jù)帶入構(gòu)建的回歸方程中，分別計算出安龍褐飛虱田間種群對5種殺蟲劑的推測抗性倍數(shù)。通過比較推測抗性倍數(shù)與稻苗浸漬法測得的實測抗性倍數(shù)，驗證使用診斷劑量評估褐飛虱抗性水平的準(zhǔn)確性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

死亡率通過對照死亡率進(jìn)行校正，LC50和LD90值及95%置信區(qū)間、斜率、卡方值和自由度等通過DPS 19.05軟件進(jìn)行計算。采用IBM SPSS 20.0軟件分析死亡率與抗性倍數(shù)之間的相關(guān)性，P<0.05表明兩者之間相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果

2.1 5種殺蟲劑對褐飛虱的診斷劑量

結(jié)果表明，吡蟲啉、啶蟲脒、醚菊酯、毒死蜱和異丙威對褐飛虱室內(nèi)敏感種群(SS)3齡若蟲的LD90分別為30.96, 92.05, 117.24, 514.21和1.24 ng/cm2(表1)。采用上述LD90劑量作為診斷劑量制作快速檢測試劑盒并分別處理敏感種群，1 h后試蟲校正死亡率介于86.25%～93.75%之間(接近90%)(表2)，表明上述診斷劑量準(zhǔn)確合理，制作的快速檢測試劑盒可用于測定田間褐飛虱種群的抗藥性水平。

表1 玻璃瓶藥膜法測定5種殺蟲劑處理1 h時對褐飛虱室內(nèi)敏感種群(SS) 3齡若蟲的毒力Table 1 Toxicity of five insecticides to the 3rd instar nymphs of the laboratory susceptible strain (SS)of Nilaparvata lugens determined by the glass vial method at 1 h after treatment

表2 褐飛虱田間種群3齡若蟲在5種殺蟲劑診斷劑量(LD90)下的校正死亡率及稻苗浸漬法抗性水平測定Table 2 Corrected mortalities of the 3rd instar nymphs of the field populations of Nilaparvata lugens exposed to fiveinsecticides at the diagnostic doses (LD90) and the resistance levels determined by the rice seedling dipping method

2.2 采用診斷劑量快速測定褐飛虱田間種群抗性水平

使用經(jīng)藥膜法測定的5種殺蟲劑診斷劑量分別處理不同田間褐飛虱種群，以快速評估褐飛虱的抗性水平。以吡蟲啉診斷劑量(30.96 ng/cm2)試劑盒藥膜瓶分別處理安順、花溪、湄潭、黃平、惠水褐飛虱田間種群3齡若蟲，1 h后5個種群的校正死亡率分別為78.75%, 71.25%, 68.75%, 58.75%和23.75%，表明不同田間種群褐飛虱對吡蟲啉的敏感性不同；通過稻苗浸漬法測得吡蟲啉對上述5個田間種群褐飛虱的LC50值分別為131.12, 151.31, 416.30, 652.76和951.97 mg/L，與敏感種群相比，抗性倍數(shù)依次是2.77, 3.20, 8.80, 13.81和20.13倍(表2)；以上兩種方法得到的田間種群對吡蟲啉敏感性變化趨勢一致。因此，可采用該診斷劑量快速測定褐飛虱田間種群對吡蟲啉的敏感性。此外，通過快速檢測試劑盒和稻苗浸漬法測定的5個褐飛虱田間種群對其他4種殺蟲劑的敏感性變化趨勢也表現(xiàn)高度一致(表2)。結(jié)果表明，該試劑盒可在1 h快速診斷田間褐飛虱種群對5種殺蟲劑的抗性水平。

2.3 快速檢測試劑盒準(zhǔn)確性的驗證

結(jié)合田間種群在診斷劑量下的死亡率和實測抗性倍數(shù)(稻苗浸漬法測定并計算獲得)，得到不同殺蟲劑的死亡率-抗性倍數(shù)線性回歸方程(圖1)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，褐飛虱田間種群3齡若蟲在快速檢測試劑盒診斷劑量下的死亡率與吡蟲啉(r=-0.949;P=0.004)、啶蟲脒(r=-0.988;P=0.000)、醚菊酯(r=-0.979;P=0.001)、毒死蜱(r=-0.969;P=0.001)和異丙威(r=-0.935;P=0.006)的實測抗性倍數(shù)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(表3)。此外，采用2021年貴州安龍褐飛虱田間種群進(jìn)一步驗證了試劑盒的準(zhǔn)確性。在吡蟲啉、啶蟲脒、醚菊酯、毒死蜱和異丙威的診斷劑量下，安龍?zhí)镩g種群褐飛虱3齡若蟲的死亡率分別為67.50%, 78.75%, 70.00%, 42.50%和36.25%(表4)。根據(jù)所擬合的褐飛虱田間種群在診斷劑量下的死亡率與實測抗性倍數(shù)的相關(guān)性方程，計算得到安龍褐飛虱種群對5種殺蟲劑的推測抗性倍數(shù)介于3.68～31.18倍之間(表4)，與采用稻苗浸漬法實測的抗性倍數(shù)(介于3.71～26.56倍)變化趨勢一致，且兩組數(shù)據(jù)顯著相關(guān)(r=0.997;P=0.000)；另外，從圖1中可以看出安龍種群褐飛虱對5種殺蟲劑的推測抗性倍數(shù)均在各擬合方程的95%置信區(qū)間內(nèi)(圖1)。結(jié)果表明，采用室內(nèi)敏感種群死亡率確定的殺蟲劑診斷劑量制備的快速檢測試劑盒具備較高的檢測準(zhǔn)確性，結(jié)合在殺蟲劑診斷劑量下的死亡率和前期建立的死亡率與抗性倍數(shù)的相關(guān)性方程，可實現(xiàn)褐飛虱田間種群對以上5種殺蟲劑抗性倍數(shù)的估算及抗性水平的快速評價。

表3 5種殺蟲劑診斷劑量下田間褐飛虱種群3齡若蟲死亡率和抗性倍數(shù)的相關(guān)性Table 3 Pairwise correlation coefficient comparison between the mortalities of the 3rd instarnymphs of field populations of Nilaparvata lugens exposed to five insecticidesat the diagnostic doses and the resistance ratio

表4 采用快速檢測試劑盒測定貴州安龍種群褐飛虱抗性水平的準(zhǔn)確性驗證Table 4 Verification of the accuracy of the rapid detection kit in determining resistance levelsin Anlong populations of Nilaparvata lugens in Guizhou

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種褐飛虱抗藥性水平快速檢測方法，并研制出用于檢測褐飛虱對5種稻田常用殺蟲劑的抗藥性快速檢測試劑盒。通過與傳統(tǒng)生物測定結(jié)果的比較，驗證了該試劑盒的有效性和準(zhǔn)確性。

該檢測試劑盒是在玻璃瓶藥膜法的基礎(chǔ)上開發(fā)的，玻璃瓶藥膜法是診斷殺蟲劑敏感性的有效途徑之一，主要針對一些個體相對較小的昆蟲，如大豆蚜Aphisglycines(Hansonetal., 2017; Ribeiroetal., 2018)、油菜露尾甲Meligethesaeneus(Slateretal., 2011)、西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Kwonetal., 2015)、 柑橘木虱Diaphorinacitri(Kangaetal., 2016)和斑翅果蠅Drosophilasuzukii(Van Timmerenetal., 2019)等。 玻璃瓶藥膜法具有快速診斷的特點，回歸方程來自圖1。這里x為推測的抗性倍數(shù)，y為診斷劑量下的校正死亡率。實際抗性倍數(shù)=田間種群LC50值/敏感種群LC50值。Regression equations are from Fig. 1. Here,xis the inferred resistance ratio, andyis the corrected mortality at the diagnostic dose. Actual resistance ratio=LC50value of field population/LC50value of the susceptible strain.

Denlinger等(2016)的研究中巴氏白蛉Phlebotomuspapatasi和長須白蛉Lutzomyialongipalpis對有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑的最短診斷時間僅為30 min。長期以來，褐飛虱田間種群的抗藥性監(jiān)測主要采用稻苗或稻莖浸漬法等，該類方法是通過殺蟲劑的內(nèi)吸、觸殺及胃毒作用來對褐飛虱進(jìn)行毒力測定，雖然可以模擬田間昆蟲對藥劑的接觸和取食過程，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，但需要花費(fèi)較長時間(包括昆蟲飼養(yǎng)時間)。抗性檢測的時效性差往往導(dǎo)致有效防治的行動滯后，同時增加了抗性昆蟲繁殖、擴(kuò)散的風(fēng)險。稻苗浸漬法反映了殺蟲劑對褐飛虱的胃毒和觸殺毒力，而玻璃瓶藥膜法主要評價殺蟲劑的觸殺毒力。對于致死作用快、觸殺毒力強(qiáng)的神經(jīng)毒劑(如吡蟲啉、毒死蜱、醚菊酯等)利于進(jìn)行快速檢測，而對于致死速率較慢的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑(噻嗪酮)和口針阻塞劑(吡蚜酮)等則不能使用藥膜法進(jìn)行快速檢測。本研究通過測定褐飛虱接觸殺蟲劑1 h的死亡率(表1)，以及構(gòu)建的死亡率-抗性倍數(shù)回歸方程(圖1)，可快速檢測出田間褐飛虱的推測抗性倍數(shù)，由于擬合回歸方程所用數(shù)據(jù)有限，在本研究所涉抗性倍數(shù)范圍內(nèi)的推測抗性水平結(jié)果準(zhǔn)確性較好，而在此范圍外的抗性倍數(shù)推測結(jié)果的準(zhǔn)確性可能稍差。

對于殺蟲劑的診斷劑量，不同昆蟲種類和不同作用方式的殺蟲劑有所差異。殷劭鑫等(2016)在使用診斷劑量處理小菜蛾P(guān)lutellaxylostella時，死亡率低于80%是害蟲產(chǎn)生抗藥性的信號。對于媒介蚊蟲，WHO(2013)明確當(dāng)其對殺蟲劑的死亡率低于90%時，則存在抗性；Denlinger等(2016)也指出，由劑量-存活率曲線確定的50%, 90%和95%的致死濃度可以作為診斷劑量的起點；Eiden等(2016)也采用敏感種群LC90, LC99, 2×LC99及4×LC99值作為診斷劑量測定昆蟲對殺蟲劑敏感性的研究。本研究通過玻璃瓶藥膜法，建立吡蟲啉、毒死蜱等5種褐飛虱常用殺蟲劑對褐飛虱室內(nèi)敏感種群的LC90值作為診斷劑量(表1)，利用5個田間種群建立死亡率-抗性倍數(shù)的線性方程(圖1)；且2021年安龍?zhí)镩g種群驗證結(jié)果(表4)表明，通過檢測試劑盒測定的死亡率及擬合方程計算的推測抗性倍數(shù)與稻苗浸漬法測定的抗性倍數(shù)之間沒有明顯差異，驗證了這5種抗藥性快速檢測試劑盒的準(zhǔn)確性。

在害蟲的抗性治理過程中，通常需要快速、準(zhǔn)確的抗藥性監(jiān)測方法來評估害蟲對殺蟲劑的敏感性水平(Matsumuraetal., 2014; Maoetal., 2019)，防治藥劑的不合理選用不僅具有直接導(dǎo)致田間害蟲防治失敗的風(fēng)險，同時存在害蟲抗性發(fā)展加快和農(nóng)藥環(huán)境污染加劇的風(fēng)險。本研究中的檢測試劑盒可以快速評價褐飛虱田間種群對多種常用藥劑的抗性水平，能夠科學(xué)指導(dǎo)防治藥劑的選擇，從而提高殺蟲劑的使用效率?？顾幮钥焖贆z測方法的推廣應(yīng)用，能夠幫助植保工作人員及時制定科學(xué)、高效的害蟲防治方案，為農(nóng)業(yè)有害生物科學(xué)防控及抗性綜合治理提供技術(shù)手段。