朱海鵬，杜 巍，曹煥煥，鐘慶楊，殷思純

（東莞市第九人民醫(yī)院感染科，廣東東莞 523000）

我國(guó)是肝病大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者將近一億，而其中尤以廣東省的 HBV 感染率居高，且約20%患者可發(fā)展成重型肝臟疾病[1-2]。因此，探討各種新型HBV 治療方法及治療分子機(jī)制一直是臨床重要的研究方向。由于慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)階段治療方法也呈現(xiàn)出復(fù)雜與多樣性，包括抗病毒治療、調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗氧化、抗纖維化等[3]。近期多項(xiàng)胸腺肽a1（Ta1）聯(lián)合恩替卡韋抗HBV臨床研究顯示，該治療方案可以提高血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）復(fù)常率、HBV病毒載量（HBV DNA）轉(zhuǎn)陰率等重要指標(biāo)，臨床常見(jiàn)不良反應(yīng)少而輕[4-6]。為此，Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療成為一個(gè)重要的臨床治療補(bǔ)充手段，針對(duì)其聯(lián)合治療的分子機(jī)制也成為一個(gè)重要課題。前期工作在研究Toll樣受體10（TLR10）在HBV感染中的作用僅發(fā)現(xiàn)TLR9和TLR10的表達(dá)與HBV載量具有相關(guān)性[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)與多種病毒感染密切相關(guān)[8-9]。本課題組在比較慢性乙型肝炎不同疾病狀態(tài)中外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞中組蛋白H3K9 在全基因組啟動(dòng)子區(qū)域乙酰化修飾狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)，TLR9基因的2個(gè)序列區(qū)存在H3K9乙?；揎椪{(diào)控，提示TLR9的H3K9乙酰化修飾在慢性乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2019年2月東莞市第九人民醫(yī)院收治的3例慢性乙型肝炎患者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，患者中男性1例，女性2例；年齡18～65歲，平均年齡（36.50±4.50）歲。本研究經(jīng)東莞市第九人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[10]中慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次檢測(cè)感染患者；③年齡18～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①HBV外其他病毒感染；②存在原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）或甲胎蛋白（AFP）≥400 ng/mL持續(xù)超過(guò)1個(gè)月；③因其他疾病需要免疫抑制治療或放療、化療；④妊娠或哺乳期患者。

1.2 研究方法 染色質(zhì)免疫共沉淀及TLR9基因H3K9乙?；瘷z測(cè)。先抽血收集臨床樣本，然后給予聯(lián)合治療，具體過(guò)程如下。抽取患者肘靜脈血5 mL，置于500 μL肝素抗凝管中，于抽血后2 h內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），采用抗凝管收集受試者血液樣本。給予患者恩替卡韋（中美上海施貴寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052237，規(guī)格：0.5 mg/片）口服治療，0.5 mg/次，1次/d，治療4周；注射用胸腺素a1（成都地奧制藥集團(tuán)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020545，規(guī)格：1.6 mg/瓶）行皮下注射，1.6 mg/次，2次/周，治療4周。全部新鮮樣本分離血液PBMCs，加入細(xì)胞裂解液，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min渦旋離心取上清。試劑盒內(nèi)MNase Digestions Buffer重 懸 沉 淀，Micrococcal Nuclease混勻水浴，MNase Stop Solution終止反應(yīng)。蛋白質(zhì)裂解液（Lysis Buffer）重懸沉淀，冰浴、渦旋、離心、收集上清。加入750 μL的DNA 結(jié)合緩沖液（Binding Buffer），加入到DNA Clean-Up柱，以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min離心棄上清。將剩余的樣品加入同一個(gè)DNA Clean-Up柱，加入750 μL DNA 柱清洗緩沖液（Column Wash Buffer），同法離心棄上清，再次離心。加入50 μL DNA 稀釋溶液（Elution Solution），同法離心收集純化DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（qPCR）檢測(cè)，引物信息見(jiàn)下文。qPCR的總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)體系，見(jiàn)表1；qPCR采用兩步法擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件如表1所示，循環(huán)數(shù)為50個(gè)循環(huán)，反應(yīng)過(guò)程為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸 1 min。

表1 qPCR反應(yīng)的反應(yīng)體系

血清白細(xì)胞液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS/MS）檢測(cè)組蛋白乙?；?。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：使用Thermo Fisher公司的血清高豐度蛋清去除試劑盒Pierce? Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns去除12種常見(jiàn)的高豐度蛋白。使用Thermo Fisher公司檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度試劑盒Pierce? BCA Protein Assay Kit給蛋白質(zhì)定量。使用AB Sciex公司的iTRAQ 試劑-多標(biāo)緩沖液試劑盒還原及封閉蛋白質(zhì)。使用Sangon公司的Trypsin TPCK Treated酶解蛋白質(zhì)。使用AB Sciex公司的iTRAQ多重試劑盒標(biāo)記iTRAQ實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)。iTRAQ實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)標(biāo)記后需要進(jìn)行第一維高Ph-rp液相分離。iTRAQ實(shí)驗(yàn)和非標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)（Label free）實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行RPLC-MS。肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、5 %乙腈）溶解，充分振蕩渦旋，13 500 r/min，4 ℃離心20 min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；流動(dòng)相A為0.1%甲酸+2%乙腈水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸+98%乙腈水溶液；流速為600 m/s，每個(gè)組分分析時(shí)間90 min。采用Proteome Discoverer 2.2進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，見(jiàn)表2。

表2 LCMS/MS檢測(cè)第二維液相梯度條件

采用Proteome Discoverer 2.2進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。軟件參數(shù)設(shè)定消化酶為Trypsin，數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot-human-filtered-organism Homo sapiens (Human) 。iTRAQ實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需要設(shè)定靜態(tài)修飾為8標(biāo)iTRAQ試劑標(biāo)記。鑒定的原始結(jié)果設(shè)置MS準(zhǔn)確度10 mg/kg，MS / MS準(zhǔn)確度0.02 Da，胰蛋白酶消化，允許兩次錯(cuò)過(guò)切割，固定的半胱氨酸的氨基甲?；谆揎椇脱趸琢虬彼岬目勺冃揎?。

HBV感染患者在入院第一天、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療1個(gè)周期、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療結(jié)束3個(gè)階段中患者血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac存在結(jié)合情況、組蛋白修飾水平。

1.3 觀察指標(biāo) ①統(tǒng)計(jì)3例受試者的臨床血清學(xué)指標(biāo)信息。②分析Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療過(guò)程中TLR9基因的H3K9乙酰化修飾。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3例受試者的臨床血清學(xué)指標(biāo)信息 本研究開(kāi)始納入了20例患者，因各種患者和疫情影響因素，最終全部治療進(jìn)程完成的患者只有3例。對(duì)納入研究的3例受試者治療不同時(shí)間段谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、凝血酶原活動(dòng)度（PTA）、HBV病毒載量等實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)信息進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表3。

表3 3例受試者的臨床血清學(xué)指標(biāo)信息（）

表3 3例受試者的臨床血清學(xué)指標(biāo)信息（）

注：ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；TBIL：總膽紅素；PTA：凝血酶原活動(dòng)度；HBV DNA：乙型肝炎病毒載量。

指標(biāo) 治療前 治療中 治療后ALT(IU/L) 867.9±108.5231.9±5.7 69.1±17.7 TBIL(μmol/L) 209.3±45.5 116.7±4.4 33.8±6.9 PTA(%) 45.7±9.2 69.9±11.881.5±10.8 HBV DNA(Log10 IU/mL) 9.32±2.3 2.19±1.160.82±0.77

2.2 Ta1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV治療過(guò)程中TLR9基因的H3K9乙酰化修飾 通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)探究了恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥過(guò)程中患者血清PBMCs細(xì)胞中，蛋白H3K9Ac與TLR9 基因啟動(dòng)序列（promoter ）區(qū)的結(jié)合情況。通過(guò)序列比對(duì)分析，TLR9基因與蛋白H3K9Ac預(yù)測(cè)的3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的驗(yàn)證引物信息，見(jiàn)圖1。

圖1 免疫共沉淀ChiP技術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同人群血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac結(jié)合情況

進(jìn)一步研究測(cè)試了3例HBV感染患者在剛?cè)朐?、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療一個(gè)周期、恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療結(jié)束3個(gè)階段中患者血清PBMCc中TLR9基因與蛋白H3K9Ac存在結(jié)合情況。結(jié)果很明顯，3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在治療過(guò)程中均有顯著的改變，尤其是位點(diǎn)2，這說(shuō)明恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥臨床增強(qiáng)免疫、抑制HBV病毒復(fù)制的過(guò)程中確實(shí)與TLR9基因與蛋白H3K9Ac有顯著的關(guān)系。

通過(guò)DNA序列分析也發(fā)現(xiàn)H3K9Ac在其他細(xì)胞模型中具備同一區(qū)域修飾模型的變化，ChiP檢測(cè)的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序我們也找到了TLR9的部門基因序列，在治療好轉(zhuǎn)的過(guò)程中起序列匹配度更好。這一點(diǎn)與固定的DNA位點(diǎn)組蛋白修飾的改變進(jìn)而誘導(dǎo)基因調(diào)控的模型是吻合的，見(jiàn)圖2。

圖2 治療前中后患者免疫共沉淀PCR產(chǎn)物測(cè)序數(shù)據(jù)（同一組樣本混合）

此外，本研究通過(guò)LCMS/MS技術(shù)也初步探討了HBV感染患者在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療過(guò)程中血清PBMc細(xì)胞組蛋白修飾的程度的變化。如圖3所示，隨著治療進(jìn)程的增加，可 在uniprot-human-filtered-organism Homo sapiens (Human)可檢索到乙?；揎椘卧龆?。這說(shuō)明恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥增加了組蛋白修飾水平，這可能會(huì)促使患者PBMc核內(nèi)的TLR9相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子釋放，增加其表達(dá)水平，改變患者免疫水平。

圖3 治療前中后期液質(zhì)LCMS/MS技術(shù)檢測(cè)患者血清PBMc中組蛋白乙H3K9?；?/p>

3 討論

本研究前期工作中，針對(duì)Tolls在HBV感染患者PBMCs上差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清中PBMCs TLR9 mRNA表達(dá)與血清HBV DNA載量具有顯著相關(guān)性?？紤]到慢性乙型肝炎患者外周血細(xì)胞中TLR9基因的2個(gè)序列區(qū)存在H3K9乙酰化修飾調(diào)控。隨后進(jìn)一步探究了3例慢性乙型肝炎患者恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治不同治療進(jìn)程過(guò)程中H3K9乙?；鞍着cTLR9的結(jié)合情況。本研究結(jié)果顯示，對(duì)納入研究的3例受試者進(jìn)行恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥，具有顯著的臨床抗病毒效果，并且整個(gè)過(guò)程中肝功能具有明顯提高。

本研究系統(tǒng)地考察了HBV感染患者在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療過(guò)程中患者血清PBMc細(xì)胞中組蛋白修飾的變化、蛋白H3K9Ac與TLR9結(jié)合情況 ，結(jié)果顯示，TLR9的H3K9乙酰化修飾在慢性乙型肝炎患者中存在并發(fā)揮了重要作用。在恩替卡韋和胸腺肽a1聯(lián)合用藥治療的過(guò)程中，TLR9的組蛋白乙?；揎楋@著提高、H3K9乙酰化蛋白與TLR9結(jié)合位點(diǎn)變化顯著，這可能會(huì)增加了TLR9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)各種炎癥因子、細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步抑制病毒增殖、發(fā)揮抗病毒效果。研究結(jié)果證實(shí)了TLR9、H3K9乙?；揎椀葏⑴cTa1聯(lián)合恩替卡韋抗HBV過(guò)程的免疫反應(yīng)，為慢性乙型肝炎抗病毒的免疫控制理論提供了新依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用意義。

綜上，在恩替卡韋和Ta1聯(lián)合用藥治療的過(guò)程中兩者的結(jié)合可能會(huì)增加TLR9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，發(fā)揮其抗病毒作用。