馬欣瑩，紀媛媛，劉奧，周煒，印伯星，劉同杰，公丕民，張?zhí)m威，易華西*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266000)2(揚大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚州，225000)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)是一種由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因缺陷所致的常染色體遺傳病[1]，患者體內(nèi)PAH活性降低或缺乏后，導致血、腦中苯丙氨酸的積累，對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[2]。苯丙氨酸不能進一步代謝為左旋多巴、甲狀腺素、多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素等，其中多巴胺、腎上腺素等與神經(jīng)精神障礙相關的認知密切相關[3]。

目前治療苯丙酮尿癥廣泛使用的方法有3種，即飲食治療[4]、酶治療[5]和基因治療[6]。然而酶療法會導致嚴重的免疫介導的不良反應和過敏反應，基因治療雖然具有一次性治療的特點，但存在價格高昂和潛在的遺傳毒性。因此，低苯丙氨酸飲食目前正受到越來越多的關注[7]。多項研究表明，益生菌具有代謝苯丙氨酸、增強腸道屏障功能、促進腸道菌群平衡等作用[8]，因此開發(fā)安全、高效的益生菌制劑及其產(chǎn)品來輔助治療苯丙酮尿癥具有重要意義。

苯丙氨酸作為一種必需氨基酸，是乳酸菌生長所必須的氮源。乳酸菌能夠合成苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo nialyase, PAL)，可以將苯丙氨酸代謝成為無毒的反式肉桂酸。此外，苯丙氨酸還可通過苯乙酸途徑、苯丙酮酸途徑進行降解[9]。ISABELLA等[10]構建了具有高苯丙氨酸解氨酶活性的基因工程菌株并成功應用于臨床。因此，益生菌有望在苯丙酮尿癥的預防和輔助治療中發(fā)揮重要作用。目前，低苯丙氨酸含量的益生元糖巨肽在疾病治療方面取得了進展[11]，但針對治療或緩解苯丙酮尿癥的益生菌的研究報道不多。本研究篩選出具有苯丙氨酸降解能力的益生菌菌株，并對這些菌株的益生菌特性及其發(fā)酵乳中的應用潛力進行了探討，以期為開發(fā)針對苯丙酮尿癥的功能性微生態(tài)制劑或特醫(yī)食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本試驗選取的31株乳酸菌，分離自發(fā)酵乳和干酪等傳統(tǒng)發(fā)酵食品和嬰兒糞便；對照菌株、鼠李糖乳桿菌LGG，均保存于中國海洋大學食品科學與工程學院功能性乳制品與益生菌工程研究室；酸奶發(fā)酵劑YF-L907(保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌)，北京多愛特生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司

L-苯丙氨酸特異選擇培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，K2HPO42.0，檸檬酸氫二胺2.0，乙酸鈉5.0，MgSO40.2，MnSO40.04，吐溫80 1.0，L-苯丙氨酸0.5，pH值(5.7±0.2)(25 ℃)。

1.1.3 主要實驗材料

L-苯丙氨酸、反式肉桂酸、全脂乳粉、白砂糖。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Sartorius 普及型pH計，德國賽多利斯普公司；Blue pard恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；LDZX-75KBS全自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 降解苯丙氨酸益生菌的篩選

實驗方法參考SU等[12]的方法略有修改。活化后的菌株以相同的OD600(0.600～0.750)取10 mL培養(yǎng)液，8 000 r/min，4 ℃離心5 min，菌體沉淀用Tris-HCl(pH 7.4)洗滌2次后重懸。反應體系中依次加入苯丙氨酸(50 mmol/L)2.5 mL，菌懸液4 mL，吐溫-80(0.5 g/L)0.5 mL并混合均勻，以不加入菌株的培養(yǎng)基作為空白對照，37 ℃水浴保溫10 min，加入HCl溶液(6 mol/L)0.2 mL終止反應，離心除去菌體后，測定上清液在280 nm下的吸光值。酶活性的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：U，酶活性，mU/mL；Mw，肉桂酸的摩爾質量，g/mol；，反應體積，mL；t，反應時間，min；ρ，生成的肉桂酸質量濃度，mg/L。

1.3.1.2 以苯丙氨酸降解率為靶標的篩選

將上述菌懸液接種于L-苯丙氨酸特異選擇培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h后離心(6 000 r/min，4 ℃，15 min)，取2.00 mL稀釋液使用茚三酮比色法測定培養(yǎng)基中苯丙氨酸含量，以不接種菌株的培養(yǎng)基作為空白對照，由接入菌株前后體系苯丙氨酸含量計算苯丙氨酸降解率。

1.3.2 降解苯丙氨酸益生菌生長特性、胃腸耐受及黏附性能測定

以2%的接種量將活化后的菌株接種于MRS肉湯中，每2 h測定培養(yǎng)體系在600 nm下的吸光值和體系的pH值，繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線。菌體活化后經(jīng)離心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)操作后，用PBS(pH 7.4)緩沖液洗滌2次后懸浮。吸取菌懸液于人工胃液中[13](胃蛋白酶0.35%、NaC1 0.2%，pH為3.0，過濾除菌)消化2 h，使用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。吸取經(jīng)人工胃液消化的菌液到人工腸液中[14](NaCl 0.44%，胰蛋白酶0.2%，NaHCO32.2%，膽鹽1.2%，pH為8.0，過濾除菌)消化4 h。存活率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：N，消化一定時間后消化液中的活菌數(shù)，CFU/mL；N0，消化0 h消化液中的活菌數(shù)，CFU/mL。

根據(jù)SHAHEEN[15]的實驗方法略有修改。取3 mL上述菌懸液與1 mL三氯甲烷混合，將混合液渦旋30 s后室溫靜置30 min。菌株表面疏水性的計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，初始菌懸液的OD600值；Ax，混合溶液中水相的OD600值。

根據(jù)丁詩瑤等[16]的實驗方法略有修改。取菌液4 mL渦旋10 s后在室溫下靜置3 h，將0.1 mL上層懸浮液加入3.9 mL PBS(pH 7.4)，菌株自聚性的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0，初始菌懸液的OD600值；A1，靜置后菌懸液的OD600值。

1.3.3 發(fā)酵乳的制備

全脂復原乳(全脂乳粉12%，白砂糖6%)60 ℃水浴30 min，均質(65 ℃，20 MPa)后迅速分裝至錐形瓶中，105 ℃下高溫殺菌5 min后，迅速冰浴冷卻至42 ℃,接種發(fā)酵劑YF-L907(保加利亞桿菌：108CFU/mL，嗜熱鏈球菌：108CFU/mL)為對照，L.plantarumYZX21的接種量分別為0、1×106、1×107CFU/mL，42 ℃發(fā)酵至pH 4.5左右，置于4 ℃下冷藏24 h后熟。酸奶冷藏后進行感官評價，貯藏期間于第1、4、7、10、13、16、19、22天測量相關理化指標。

1.3.4 pH和滴定酸度測定

將發(fā)酵乳樣品置于室溫平衡一定時間，采用pH計進行測定，每2 h測定1次，至發(fā)酵終點(pH 4.5)。在冷藏期間每3 d測量1次pH值。滴定酸度測定參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》。

1.3.5 活菌數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.3.6 感官評價

參照中國乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)范RHB 103—2004《酸牛乳感官質量評鑒細則》，選取10名評價員從色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味、滋味5個方面對發(fā)酵乳進行感官評價。

1.3.7 發(fā)酵乳中蛋白質和苯丙氨酸含量的測定

將發(fā)酵乳適當稀釋后，用BCA試劑盒測定發(fā)酵乳中的蛋白質濃度。氨基酸分析使用氨基酸分析儀測定，準確稱取2.0 g發(fā)酵乳樣品，加入1.5 mL質量分數(shù)為5%磺基水楊酸，充分振蕩后，5 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液過0.22 μm的水相濾膜后裝入液相管備用。上樣量為10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism er8.02進行統(tǒng)計分析。結果用均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 降解苯丙氨酸益生菌的篩選

采用茚三酮比色法和分光光度法，以苯丙氨酸降解能力和苯丙氨酸解氨酶酶活性為指標，菌株初篩結果見表1。

經(jīng)過初篩得到L.plantarumYZX21和動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)F1-7，2株菌株的苯丙氨酸降解率分別為12.43%和10.09%(表1)。L.plantarumYZX21的苯丙氨酸降解率最高，可能是由于苯丙氨酸作為乳酸菌生長的必需氨基酸之一，通過苯丙氨酸解氨酶對苯丙氨酸進行降解，這與HUANG等[9]發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸可以通過肉桂酸代謝途徑進行降解的研究報道一致。進一步測定了2株菌的苯丙氨酸解氨酶酶活性，結果顯示L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的苯丙氨酸解氨酶活性分別為28.62和24.23 mU/mL。這與苯丙氨酸降解率分析的結果一致，同時也說明不同菌株對苯丙氨酸的降解能力與苯丙氨酸解氨酶活性相關。

2.2 降解苯丙氨酸益生菌的生長和產(chǎn)酸特性測定

菌株的生長和產(chǎn)酸能力是評價其生產(chǎn)應用潛力的重要指標。對L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的生長特性和產(chǎn)酸特性進行分析，結果如圖1所示。

表1 菌株初篩實驗結果Table 1 Experimental results of strain screening

a-生長曲線；b-產(chǎn)酸曲線圖1 生長特性和產(chǎn)酸特性Fig.1 Growth characteristics and acid production characteristics

L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的生長特性與產(chǎn)酸特性相似，培養(yǎng)2 h左右即進入對數(shù)期，培養(yǎng)18 h左右生長、產(chǎn)酸趨于穩(wěn)定；在對數(shù)期間，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基的pH值逐漸下降；穩(wěn)定期時培養(yǎng)基的pH值為3.6，表明L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7均具有較強的產(chǎn)酸能力，具有研究與開發(fā)低苯丙氨酸發(fā)酵食品的潛力[17]。

2.3 降解苯丙氨酸益生菌的胃腸環(huán)境耐受和定植能力評價

益生菌能夠發(fā)揮作用的前提是以一定數(shù)量的活菌形式到達腸道，對胃液和腸液環(huán)境具有一定的耐受性。胃液的pH值一般為2～3，食物成分在胃中一般停留時間為2～4 h，同時人體腸液中膽鹽濃度一般在0.03～0.30 g/100 mL[18]。體外實驗對L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的胃腸液耐受性進行了測定。結果表明(圖2-a)，雖然胃液和腸液對這2株菌的生存和增殖具有一定的抑制作用，但L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7均具有較強的抵抗胃酸和腸液的低pH值能力，其中L.plantarumYZX21在腸液中的存活率為76.91%，顯著高于B.animalisF1-7。

益生菌在腸道中的黏附是益生菌在腸道定植發(fā)揮益生作用的重要因素之一。通過疏水性和自聚性的測定評價了L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的腸道黏附能力。結果表明L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7的疏水性無顯著差異，但在自聚性方面，L.plantarumYZX21顯著高于B.animalisF1-7(圖2-b)，這表明L.plantarumYZX21的黏附能力優(yōu)于B.animalisF1-7，后續(xù)選擇L.plantarumYZX21進一步研究。

a-胃腸液耐受性；b-黏附能力圖2 胃腸液耐受性和定植能力Fig.2 Gastrointestinal tolerance and adhesion ability

2.4 L.plantarum YZX21對酸奶發(fā)酵和貯藏的影響

以市售發(fā)酵劑YF-L907(含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)生產(chǎn)的發(fā)酵乳為對照，研究了不同添加量L.plantarumYZX21(1×106和1×107CFU/mL)在酸奶發(fā)酵中的應用潛力，結果如圖3所示。

a-發(fā)酵過程pH變化；b-發(fā)酵過程酸度變化；c-發(fā)酵過程活菌數(shù)變化；d-冷藏過程pH變化圖3 植物乳桿菌YZX21對酸奶發(fā)酵和冷藏過程中pH、酸度和活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of L.plantarum YZX21 on pH, acidity and iable count during yogurt fermentation and storage at 4 ℃

與市售發(fā)酵劑YF-L907相比，接種L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳pH值和酸度變化均稍晚于對照組，但添加L.plantarumYZX21對酸奶的整體發(fā)酵進程沒有影響。此外，從圖3-a，3-b可知，L.plantarumYZX21對發(fā)酵乳產(chǎn)酸貢獻不大，這與L.plantarumYZX21在MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸特性不一致，表明L.plantarumYZX21的產(chǎn)酸特性與發(fā)酵底物有關。此外，添加L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳活菌數(shù)量高于對照組，結合發(fā)酵過程中pH值和酸度變化結果(圖3-a，3-b)，推測L.plantarumYZX21與發(fā)酵劑菌株(嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌)具有一定的協(xié)同共生作用。L.plantarumYZX21對酸奶發(fā)酵的整體進程沒有影響，表明其可以作為輔助發(fā)酵劑應用于酸奶發(fā)酵。在冷藏期間，3組發(fā)酵乳的pH值緩慢降低，說明發(fā)酵乳樣品的后酸化進程緩慢，L.plantarumYZX21的加入不會導致發(fā)酵乳的后酸化，再次表明L.plantarumYZX21具有發(fā)酵乳輔助發(fā)酵菌株的應用潛能。

2.5 L.plantarum YZX21對發(fā)酵乳感官品質的影響

從色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味、滋味等方面研究了L.plantarumYZX21對發(fā)酵乳感官特性的影響，結果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵乳的感官評價結果Fig.4 Sensory ealuation of fermented milk

接種L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳在口感和滋味這2個方面的評價結果優(yōu)于對照組，添加不同劑量的L.plantarumYZX21發(fā)酵乳口感得分分別為23.50和22.25，顯著高于商業(yè)發(fā)酵乳，在滋味上得分分別為22.00和20.50，高于商業(yè)發(fā)酵乳，但無顯著差異。這可能與L.plantarumYZX21代謝苯丙氨酸等芳香族氨基酸產(chǎn)生特殊風味物質有關，表明L.plantarumYZX21可以改善酸奶的感官特性。

2.6 L.plantarumYZX21對發(fā)酵乳苯丙氨酸含量的影響

研究比較了添加和未添加L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳中蛋白質和苯丙氨酸的含量變化。結果表明L.plantarumYZX21具有較強的乳蛋白和苯丙氨酸降解能力(表3)。

表3 發(fā)酵乳蛋白質和苯丙氨酸含量的變化 單位：mg/mL

對照發(fā)酵乳樣品中苯丙氨酸的含量為1.159 3 mg/mL。相較于對照組發(fā)酵乳，接種不同劑量L.plantarumYZX21的發(fā)酵乳苯丙氨酸含量分別下降了11.39%和13.10%，且呈現(xiàn)劑量依賴性，YANG等[19]對乳酸菌發(fā)酵豆乳過程苯丙氨酸的含量變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆乳中的苯丙氨酸含量呈緩慢下降趨勢，這與本研究結果類似，但對苯丙氨酸降解及其調控機制還有待進一步深入研究。

3 結論

以苯丙氨酸降解能力和苯丙氨酸解氨酶酶活性為篩選靶標，篩選出高效降解苯丙氨酸的L.plantarumYZX21和B.animalisF1-7，且2株菌的生長特性與益生特性良好。將L.plantarumYZX21作為輔助發(fā)酵劑應用于發(fā)酵乳，L.plantarumYZX21對發(fā)酵和冷藏過程中的pH、酸度、活菌數(shù)均無負面影響，同時能夠有效降低發(fā)酵乳中苯丙氨酸含量。綜上所述，L.plantarumYZX21具有明顯的苯丙氨酸降解能力，有望作為輔助發(fā)酵劑應用于酸奶發(fā)酵，為苯丙酮尿癥患者開發(fā)低苯丙氨酸的功能性發(fā)酵食品。