胡云峰，潘悅，陳君然,朱彥華

1(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300457)2(早康枸杞股份有限公司,寧夏 中寧,755100)

枸杞是我國藥食兩用的傳統(tǒng)藥材，富含營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分，是良好的滋補品，具有極大的開發(fā)價值和廣闊的應(yīng)用前景。類黑精是美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的褐色大分子高聚物，具有較強的抗氧化、抗菌、促進(jìn)鐵吸收等多種活性[1-2]。最近科研人員對于采用美拉德反應(yīng)制備類黑精活性成分，及對其結(jié)構(gòu)、活性分析方面進(jìn)行了大量研究[3-4]。毛肇潔等[5]在對小磨香油的研究中發(fā)現(xiàn)類黑精有較強的抗氧化活性。劉志等[6]將人參高溫蒸煮后，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸與人參皂苷上水解產(chǎn)生的糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的類黑精增強了人參的抗氧化活性。趙天琦等[7]報道，經(jīng)九蒸九曝加工制備的黑參富集了大量類黑精物質(zhì)，具有更強的抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。

熟化枸杞子是基于美拉德反應(yīng)，將枸杞經(jīng)高溫、高濕熟化而成，熟化期間產(chǎn)生了大量的黑褐色類黑精物質(zhì)，抗氧化活性也有了較大提高[8]。目前純化類黑精的方法，主要有樹脂純化與超濾分離，其中，王月麗[9]利用超濾技術(shù)將黑蒜類黑精根據(jù)分子質(zhì)量的不同分為了4個組分；何健等[10]利用X-5型樹脂精制了曲霉型豆豉類黑精；王明慧[11]在研究糯米藕類黑精中采用了大孔樹脂與凝膠層析聯(lián)用的方法進(jìn)行純化。本實驗在乙醇溶液提取熟化枸杞類黑精的基礎(chǔ)上，采用大孔吸附樹脂法，根據(jù)現(xiàn)有研究與類黑精特性，選擇樹脂極性以弱極性與非極性為主、相差較大的比表面積、平均孔徑與粒徑的樹脂。比較6種大孔吸附樹脂[12-13]對枸杞熟化產(chǎn)物類黑精的靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸和動態(tài)解吸中的效果，并測定了純化前后類黑精的抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

中寧干枸杞:產(chǎn)于寧夏，早康枸杞股份有限公司，含水量3%；大孔吸附樹脂(AB-8、HPD-100、CAD-40、X-5、D101、D312)，東鴻化工有限公司；乙醇(分析純)，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；鹽酸、氫氧化鈉、DPPH、水楊酸硫酸鐵、氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸，均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HY-2調(diào)速多用振蕩器，國華電器有限公司；DBS-100電腦全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熟化枸杞的制備

采用王娜[8]的方法，將枸杞洗凈，瀝干，裝入聚乙烯盤中，每盤枸杞不多于30 g。置于60 ℃的烘箱中加熱處理48 h，即得到熟化枸杞。

1.3.2 枸杞熟化產(chǎn)物類黑精粗提物的制備

參照文獻(xiàn)[14-16]的方法，將熟化枸杞研磨碾碎，用稀釋后的乙醇溶液在45 ℃下提取，抽濾獲得提取液，加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%。透析2 d，以除去游離的單糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，最后冷凍干燥得到類黑精粗提物。

1.3.3 類黑精的檢測波長

類黑精顏色呈深褐色，其最大吸收峰值在420 nm左右[17]，因此本研究選取420 nm作為熟化枸杞類黑精的檢測波長。將提取出的類黑精粗提物，分別配制成質(zhì)量濃度0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL溶液，在420 nm下測定吸光度。在420 nm下的吸光度值隨著枸杞熟化產(chǎn)物類黑精濃度的升高而升高，兩者間呈顯著的正相關(guān),y=0.808x+0.029 8(R2=0.995 8)，符合朗伯比爾定律，因此選擇420 nm作為類黑精的檢測波長是可行的。

1.3.4 大孔吸附樹脂的篩選

采用靜態(tài)吸附解析法評估大孔樹脂純化的效果，樹脂的預(yù)處理工藝參照鄭佳佳[18]的方法，具體工藝如下：

無水乙醇中浸泡24 h→用純水洗至流出液不渾濁→5% HCl溶液通過樹脂柱，浸泡2 h左右→純水洗至中性→2% NaOH溶液通過樹脂柱，浸泡2 h左右→純水洗至中性→待用

表1 大孔吸附樹脂的物理特性Table 1 Physical properties of macro-orous resins

1.3.5 靜態(tài)吸附容量及吸附率的計算

準(zhǔn)確稱取樹脂5 g置于100 mL錐形瓶中，加入30 mL 5 mg/mL的類黑精粗提液，在振蕩器中振蕩24 h，充分吸附后過濾，分別測定樹脂吸附前后樣液在420 nm下的吸光度值，吸附容量按公式(1)計算；吸附率按公式(2)計算：

(1)

(2)

式中：Q，吸附容量，mg/g;ω0，樣液中類黑精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；ω1，吸附液中類黑精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；，吸附液體積，mL；m，樹脂質(zhì)量，g；E，吸附率，%。

1.3.6 解析率的計算

取吸附后的樹脂加入一定濃度的30 mL乙醇溶液進(jìn)行解吸。置于振蕩器中振蕩24 h，充分解吸后過濾，測定解吸液在420 nm下的吸光度值，解析率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：B，解析率，%；ω2，解析液中類黑精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；1，解析液體積，mL；ω0，樣液中類黑精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；ω1，吸附液中類黑精的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；，吸附液體積，mL。

1.3.7 解析劑濃度對類黑精解析率的影響

為探究最佳洗脫液濃度，稱取5 g飽和的AB-8樹脂，分別加入20%、40%、60%、80%、100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為洗脫劑，測定洗脫液在420 nm下的吸光度值，計算解析率。

1.3.8 類黑精的動態(tài)吸附試驗

調(diào)整自動收集器，每2 min收集1管樣品[19]，用48 mL 40%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，于420 nm下測定收集樣品的吸光度值。

1.3.9 總還原力的測定

參考韓慧敏[20]的方法，采用鐵氰化鉀法在700 nm波長處測定其吸光度值。吸光度值越大，說明還原能力越強。

1.3.10 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基[19]，參考陳放[21]的方法，取1 mL樣品加入4 mL 95%乙醇溶液和2 mL 0.05 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，搖勻，黑暗反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定其吸光度值。DPPH清除率按公式(4)計算：

(4)

式中：A0，空白對照組的吸光度值；A1，樣品組的吸光度值；A2，不加反應(yīng)劑的樣品的吸光度值。

1.3.11 ·OH清除能力

參考王文祥[22]的方法，采用水楊酸捕獲Fenton反應(yīng)[·OH]法，在510 nm波長下測其吸光度值，·OH清除率按公式(5)計算：

(5)

式中：A0，空白對照組的吸光度值；A1，樣品組的吸光度值；A2，不加反應(yīng)劑的樣品吸光度值。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析

本實驗設(shè)置3個平行組，數(shù)據(jù)在Excel中統(tǒng)計與整理，在Origin 2017中繪圖，應(yīng)用SPSS 19統(tǒng)計軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號樹脂對類黑精的靜態(tài)吸附效果

由于不同型號樹脂的粒徑孔徑不同，導(dǎo)致樹脂吸附率不同。由圖1可以看出，不同型號的樹脂吸附率依次是AB-8(弱極性)>D101(非極性)>D312(非極性)>X-5(弱極性)>CAD-40(弱極性)>HPD-100(非極性)，其中AB-8型樹脂的吸附率最高為70.24%，吸附容量為6.322。分析原因可能是由于AB-8型樹脂對比同為弱極性的X-5樹脂與CAD-40樹脂，其孔徑更為合適，X-5樹脂的孔徑過大，CAD-40樹脂的孔徑過小都不利于吸附。AB-8 樹脂的孔徑略大于D101、D312、HPD-100三種樹脂更有利于吸附。在P<0.05水平下AB-8型樹脂吸附率顯著高于其他組，AB-8型樹脂吸附效果最好，可以推出枸杞熟化產(chǎn)物類黑精為弱極性物質(zhì)。

圖1 六種型號樹脂對類黑精的吸附率Fig.1 Adsorption capacities of six resins of melanoidins 注：圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著(下同)

2.2 不同型號樹脂對類黑精的靜態(tài)解吸效果

由圖2可知，各個類型樹脂的解析率均在80%以上，其中AB-8、CAD-40、HPD-100這3種樹脂的解析率較高，且這3種樹脂的解析率均在88%以上，AB-8略高于其他2種樹脂，其解析率為88.84%。6種樹脂之間的解吸率不存在顯著性差異(P<0.05)，結(jié)合吸附率的實驗結(jié)果，AB-8的吸附率和解析率都是最高的，因此可以選取AB-8大孔吸附樹脂作為類黑精的純化分離樹脂。

圖2 六種型號樹脂對類黑精的解吸率Fig.2 Desorption capacities of six resins of melanoidins

2.3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對類黑精解析率的影響

根據(jù)王明慧[11]以及何健等[10]樹脂純化類黑精的方法，使用乙醇溶液作為解吸劑。由圖3可知，類黑精的解析率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)逐漸提高，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，其中20%的乙醇由于體積分?jǐn)?shù)過低，無法使類黑精被充分解析出來，此時類黑精的解析率最低，僅為77.98%；而當(dāng)使用100%乙醇時則可能由于乙醇極性過大，不利于類黑精的析出，類黑精的解析率也較低，為83.12%；乙醇溶液為40%、60%、80%時，類黑精的解析率均較高，在95%以上，綜合考慮成本，選擇40%的乙醇溶液作為解析劑。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對AB-8樹脂靜態(tài)解吸結(jié)果Fig.3 Effects of different alcohol concentrations on static desorption capacity of AB-8 resin

2.4 40%乙醇溶液與AB-8樹脂對類黑精的動態(tài)解吸效果

圖4為采用弱極性AB-8樹脂作為純化分離樹脂、40%乙醇溶液作為解析劑的類黑精動態(tài)解吸效果。

圖4 40%的乙醇溶液的動態(tài)洗脫曲線Fig.4 Dynamic desorption cure of 40% alcohol concentration

采用40%的乙醇溶液作為解析劑，可以很好地洗脫吸附在AB-8樹脂上的類黑精，以1.5 mL/min的速度洗脫，在第8管時即可到達(dá)頂峰，第18管時已基本洗脫干凈，由此可見，40%的乙醇溶液對于類黑精的洗脫速度快、且洗脫出的類黑精比較集中。因此，采用40%的乙醇溶液可以把類黑精基本洗脫完成，且峰形較對稱、無拖尾。

2.5 最佳純化條件下獲得的熟化枸杞類黑精活性分析

為檢測純化效果及純化工藝對類黑精活性的影響，分別測定了類黑精純化前后的總還原力、DPPH自由基清除能力及·OH清除能力。其中S1為樹脂純化前粗類黑精，S2為純化后類黑精。

還原能力是評判物質(zhì)抗氧化活性高低的重要指標(biāo)，一般與抗氧化能力呈正相關(guān)。由圖5可知，對照組(維生素C)與S1組分、S2組分存在顯著性差異。在相同濃度下，對照組的總還原力均比純化前后的類黑精要高，但經(jīng)過純化后的S2組分的總還原力比純化前S1組分的總還原力要高，從0.836提高到了1.36。

圖5 純化工藝對總還原力的影響Fig.5 Effects of resin purification on total reducing power

由圖6可知，S2組分與對照組不存在明顯差異，與S1組分存在明顯差異(P<0．05)。經(jīng)過純化以后，類黑精的DPPH自由基清除能力得到明顯提高，S2組分的DPPH自由基清除能力不僅比S1組分高，與對照組相比也略有提高，分別提高了35.43%和2.88%。

圖6 純化工藝對DPPH清除能力的影響Fig.6 Effects of resin purification on DPPH eliminating ability

由圖7所示，S2組分與對照組和S1組分存在明顯差異(P<0.05)。純化后的S2組分的·OH清除能力明顯要高出對照組與未純化的S1組分，純化前的S1組分與對照組的·OH清除率分別為39.03%和42.26%，兩者相差不大，但純化后的S2組分的·OH清除率達(dá)到了65.77%，相比于對照組與S1組分清除率提高了1倍。由上述結(jié)果可知，經(jīng)此工藝純化后的類黑精純度有了較大提高，活性也保持較好。

圖7 純化工藝對·OH清除能力的影響Fig.7 Effects of resin purification Hydroxyl radical scaenging ability

3 結(jié)論

基于美拉德反應(yīng)對枸杞進(jìn)行了熟化處理，對其美拉德反應(yīng)的活性產(chǎn)物類黑精進(jìn)行了分離純化，研究大孔吸附樹脂對類黑精的吸附、解析效果的影響，以及乙醇解析劑濃度對熟化枸杞類黑精的解析效果影響，最終確定采用AB-8型大孔吸附樹脂作為純化樹脂，40%的乙醇溶液作為解吸劑，在該工藝條件下類黑精的洗脫速度快、洗脫出的類黑精也較為集中。本研究與王明慧[11]純化糯米藕類黑精選取的樹脂相同，都是AB-8型樹脂，何健等[10]純化曲霉型豆豉類黑精篩選的樹脂為X-5，洗脫劑濃度為60%，選取的樹脂多為弱極性，根據(jù)極性相似相容原理，說明熟化枸杞類黑精也為弱極性物質(zhì)。解吸劑乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)不同，相對應(yīng)的極性也不同，會影響類黑精在乙醇溶液的溶解度，類黑精在合適的洗脫劑濃度下，解析率相應(yīng)較高，不同產(chǎn)物的類黑精極性會有所不同。

對其純化產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化分析發(fā)現(xiàn)，與純化前相比，純化后產(chǎn)物的總還原力從0.836提高到1.36，·OH清除能力提高了26.74%，DPPH自由基清除能力提高了35.43%，與鄭佳佳[18]在研究酒糟類黑精UF3組分樹脂純化后·OH清除率提升了10.06%；鄭金德[23]在研究啤酒類黑精中，非極性UF4組分經(jīng)樹脂純化后的抗氧化性最強一致。綜上，說明AB-8型樹脂可以富集類黑精中有效成分，純化之后的類黑精表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。為之后進(jìn)一步研究熟化枸杞類黑精提供了基礎(chǔ)研究方法，對熟化枸杞類黑精的結(jié)構(gòu)與活性有待進(jìn)一步研究。