張盼文，李浩，徐鈺紅，楊慧林，王筱蘭

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，具有抗逆境能力強(qiáng)、抑制病原菌、產(chǎn)酶種類(lèi)豐富等優(yōu)良特性[1-2]，非常適用于食品發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。在傳統(tǒng)食品曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中，地衣芽孢桿菌在大豆發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，該菌具有良好的耐鹽性能[3]，發(fā)酵大豆的特征性芳香物質(zhì)及關(guān)鍵的揮發(fā)性風(fēng)味化合物和地衣芽孢桿菌息息相關(guān)[4]。這類(lèi)菌可產(chǎn)生多種酶類(lèi)分解生物大分子物質(zhì)形成風(fēng)味物質(zhì)前體[5]，從而促進(jìn)了豆豉風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。其分泌的糖苷酶[6]主要降解豆豉中的纖維素等糖類(lèi)物質(zhì)生成葡萄糖以及代謝途徑中的其他小分子化合物，進(jìn)而和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)[7]，賦予豆豉獨(dú)特的香氣。

楊林子等[8]基于GC-MS探究了郫縣豆瓣醬中的地衣芽孢桿菌在化學(xué)體系中的酯合成途徑和能力；SHAH等[9]對(duì)海洋地衣芽孢桿菌生產(chǎn)更高纖維素酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化；KURIBAYASHI等[10]對(duì)來(lái)自地衣芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶在離子交換樹(shù)脂中的固定化進(jìn)行研究，以利于生產(chǎn)低乳糖或無(wú)乳糖乳制品。上述研究表明地衣芽孢桿菌有豐富的酶類(lèi)資源和良好的發(fā)酵潛能，其代謝潛力有待進(jìn)一步研究。目前已有一些學(xué)者利用基因工程和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法等技術(shù)探究及改善該菌的產(chǎn)酶及發(fā)酵性能[11]，但是從全基因組角度上對(duì)于該物種在大豆發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)理的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌存在于傳統(tǒng)豆豉發(fā)酵過(guò)程中的各個(gè)階段，并且在發(fā)酵中后期占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位[12]。豆豉發(fā)酵過(guò)程中，因?yàn)楦邷睾桶棼}的影響，葡萄球菌等大部分微生物含量都逐漸下降，而地衣芽孢桿菌的耐鹽和抗菌特性及其分泌蛋白酶和糖苷酶的能力對(duì)豆豉后發(fā)酵階段風(fēng)味的產(chǎn)生仍有重要作用。因此，本研究利用全基因組測(cè)序技術(shù)獲取地衣芽孢桿菌JXNUWL7完整基因組序列，分析預(yù)測(cè)該菌株可能的功能基因和風(fēng)味物質(zhì)代謝機(jī)理，同時(shí)通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)其純種發(fā)酵豆豉產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，為地衣芽孢桿菌在豆制品發(fā)酵中的功能性作用及潛在應(yīng)用價(jià)值方面的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

JXNUWL7菌株，江西省南昌市稻香園調(diào)味食品有限公司生產(chǎn)的曲霉型豆豉中分離篩選獲得；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、NaOH、HCl、NaCl(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液肉湯BHI Broth，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基[13](g/L)：CMC-Na 10，蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂20，pH (7.2±0.2)。

1.3 儀器與設(shè)備

HICO21臺(tái)式離心機(jī)，生工上海股份有限公司；PowerEase 90 W核酸凝膠電泳儀、HWS26電熱恒溫水浴鍋，上海申安器械廠；QL-901旋渦振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；T100型PCR儀，Bio-Rad公司；固相微萃取裝置(包括手柄和DB/CAR/PDMS萃取頭)，Supelco公司；7890A/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 全基因組測(cè)序樣品制備

將實(shí)驗(yàn)室低溫(-80 ℃)保藏的JXNUWL7菌株復(fù)蘇后接種于100 mL BHI液體種子培養(yǎng)基中，35 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液；參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的方法提取菌株的基因組。

1.4.2 全基因組測(cè)序和組裝

地衣芽孢桿菌JXNUWL7的基因組DNA經(jīng)提取后通過(guò)Illumina HiSeq×10測(cè)序平臺(tái)完成全基因組測(cè)序，對(duì)符合要求的Clean data進(jìn)行從頭組裝得到基因組序列，進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化后利用短序列組裝軟件SOAPdenoo2進(jìn)行拼接。

1.4.3 菌種種屬鑒定

僅通過(guò)16S rRNA基因序列分析的方法難以鑒別枯草芽孢桿菌菌群中的物種，編碼DNA回旋酶B亞單位蛋白的gyrB基因[14]被選中作為一種替代的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記用于物種鑒定。根據(jù)菌株JXNUWL7全基因組注釋結(jié)果，選取其中16S rRNA和gyrB基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA 7.0.26軟件的鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.4 基因的預(yù)測(cè)與注釋

利用tRNAscan-SE 2.0、Barrnap、Glimmer軟件分別對(duì)該菌株基因組中包含的tRNA、rRNA和編碼序列(coding sequence, CDS)進(jìn)行預(yù)測(cè)；將該菌株全基因組序列與6大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)比對(duì)進(jìn)行功能注釋?zhuān)褂肈iamond軟件比對(duì)eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株進(jìn)行COG和KEGG功能注釋?zhuān)褂肂LAST2 go軟件比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株進(jìn)行GO功能注釋。

1.4.5 CAZymes酶類(lèi)注釋及驗(yàn)證

利用Diamond、hmmscan軟件對(duì)菌株JXNUWL7的碳水化合物活性酶(carbohydrate-actie enzymes, CAZymes)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將活化的JXNUWL7菌株分別接入CMC-Na培養(yǎng)基中，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。用0.2%剛果紅染色15 min，然后用1 mol/L NaCl溶液清洗2次后觀察是否產(chǎn)生透明圈。

1.4.6 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

通過(guò)antiSMASH軟件(http://antismash.secondarymetabolites.org)對(duì)樣本的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4.7 菌株培養(yǎng)及單菌發(fā)酵豆豉

將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株JXNUWL7復(fù)蘇后轉(zhuǎn)接到100 mL液體種子培養(yǎng)基中，于37 ℃，170 r/min培養(yǎng)24 h，振蕩培養(yǎng)到菌懸液的OD600為0.8時(shí)停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌懸液和滅菌(121 ℃，20 min)處理的黑豆按1∶10(mL∶g)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行接種，均勻混合后覆上滅菌過(guò)的保鮮膜，在42 ℃發(fā)酵25 d。培養(yǎng)結(jié)束后，用GC-MS分別測(cè)定3組平行樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

1.4.8 風(fēng)味化合物萃取

分別取發(fā)酵25 d的3組平行樣品進(jìn)行研磨，過(guò)40目篩后稱(chēng)取3 g樣品加到15 mL頂空進(jìn)樣瓶中，60 ℃恒溫水浴平衡20 min，將SPME裝置置于進(jìn)樣瓶上方，60 ℃萃取30 min，通過(guò)GC-MS進(jìn)行分析。

1.4.9 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent 19091S-433毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1 mL/min，分流進(jìn)樣；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，5 ℃/min升至60 ℃，10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI，電離電壓70 e；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；MS1全掃描模式。

1.4.10 風(fēng)味化合物的鑒定和含量計(jì)算

將各組分質(zhì)譜信息與NIST17.L質(zhì)譜庫(kù)對(duì)照，確定各組分成分。以質(zhì)譜峰面積代表各組分含量，用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組概況及組分分析

對(duì)菌株JXNUWL7進(jìn)行全基因組的測(cè)序，結(jié)果如表1所示，菌株全長(zhǎng)為4 194 676 bp，GC含量為46.07%，包含45個(gè)重疊群(contigs)，長(zhǎng)度>9 000 bp的重疊群有31個(gè)?；蛟A(yù)測(cè)結(jié)果顯示共有4 684個(gè)CDS，77個(gè)tRNA和8個(gè)rRNA，由基因長(zhǎng)度分布圖(圖1)可得預(yù)測(cè)基因長(zhǎng)度在150～299 bp的基因數(shù)量最多(667個(gè)，14.24%)。

表1 菌株JXNUWL7基因組組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Genome assembly results of strain JXNUWL7

圖1 菌株JXNUWL7編碼基因長(zhǎng)度分布Fig.1 CDS length distribution of strain JXNUWL7

16S rRNA和gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖2)，菌株JXNUWL7為地衣芽孢桿菌。將菌株JXNUWL7的全基因組序列提交至NCBI，獲得登錄號(hào)為：JAJAU000000000。

a-基于16S rRNA序列；b-基于gyrB序列圖2 菌株JXNUWL7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain JXNUWL7

2.2 基因功能注釋

2.2.1 基礎(chǔ)注釋

通過(guò)比對(duì)EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息對(duì)菌株JXNU7基因組進(jìn)行COG注釋結(jié)果表明，共有3 379個(gè)CDS具有COG功能注釋結(jié)果(圖3)，占基因總數(shù)的72.14%。其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝是主要代謝過(guò)程，相關(guān)CDS分別為309個(gè)(9.14%)和300個(gè)(8.88%)，主要的COG功能分別注釋為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS)組成成分和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與物質(zhì)運(yùn)輸，維持細(xì)胞滲透壓平衡，可能和該菌的耐鹽能力相關(guān)[15]。

GO注釋結(jié)果(圖4)顯示有3 197個(gè)CDS注釋歸到3大類(lèi)43個(gè)條目中，在生物學(xué)過(guò)程分類(lèi)中，參與氧化還原過(guò)程和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的CDS最多，分別為310個(gè)(6.62%)和265個(gè)(8.29%)；在細(xì)胞成分分類(lèi)中，膜的組成部分注釋到的CDS數(shù)量最多，為1 024個(gè)(32.03%)；在分子功能分類(lèi)中，注釋到與ATP結(jié)合和DNA結(jié)合功能相關(guān)的CDS最多，分別為355個(gè)(11.10%)和307個(gè)(9.60%)。

A-RA加工和修飾；B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C-能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化；D-細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分裂；E-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F-核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G-碳水化合物運(yùn)輸和代謝；H-輔酶運(yùn)輸和代謝；I-脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；K-轉(zhuǎn)錄；L-復(fù)制、重組和修復(fù)；M-細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N-細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O-翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶；P-無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q-次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝；R-僅一般功能預(yù)測(cè)；S-功能未知；T-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡 運(yùn)輸；-防御機(jī)制；W-細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y-核結(jié)構(gòu)；Z-細(xì)胞骨架圖3 GOG注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig.3 COG annotation classification statistics chart

KEGG通路注釋結(jié)果顯示(圖5)，共2 276個(gè)基因注釋到6個(gè)信號(hào)通路層次202條通路中。在代謝層次，與碳水化合物代謝(290個(gè))和氨基酸代謝(209個(gè))相關(guān)的基因占比最多。此外，KEGG共注釋到了41個(gè)PTS系統(tǒng)，其中和纖維素代謝相關(guān)的PTS系統(tǒng)數(shù)最多(18個(gè))。

圖4 GO注釋分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig.4 GO annotation classification statistics chart

如圖6所示，JXNUWL7基因組中包含15條碳水化合物代謝通路信息，且淀粉和蔗糖代謝的基因數(shù)量最多(59個(gè))。碳代謝注釋結(jié)果表明菌株JXNUWL7可能代謝多種糖類(lèi)，其中間產(chǎn)物將進(jìn)入其他代謝通路進(jìn)一步參與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和功能性物質(zhì)的合成。此外，地衣芽孢桿菌JXNUWL7含有129個(gè)與雙組分系統(tǒng)相關(guān)的基因和128個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，這些系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌感應(yīng)環(huán)境刺激和適應(yīng)環(huán)境脅迫有重要作用[16-17]。

圖5 菌株JXNUWL7的KEGG注釋通路分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig.5 Classification statistics of KEGG annotation pathway about strain JXNUWL7

圖6 JXNUXL7碳水化合物代謝通路統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Statistical diagram of JXNUXL7 carbohydrate metabolism metabolic pathways

2.2.2 碳水化合物活性酶CAZy注釋

將基因組序列與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株JXNUWL7的基因組中共有116個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑AZy家族，包括30類(lèi)糖苷水解酶家族(glycoside hydrolases, GHs)48個(gè)、10類(lèi)糖苷轉(zhuǎn)移酶家族(glycosyl transferases, GTs)34個(gè)、7類(lèi)碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)14個(gè)、11類(lèi)碳水化合物結(jié)合組件(carbohydrate-binding modules, CBMs)12個(gè)和7類(lèi)多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)8個(gè)。其中注釋為GT2、GT4、GT51、GH1、GH4、CE4和CE12的基因序列數(shù)量相對(duì)較多。研究表明，24%的原核生物中存在編碼含有纖維素酶的GH家族的基因[18]，其中GH1和GH3家族的基因編碼β-葡萄糖苷酶，而其他GH家族存在編碼內(nèi)切和外切葡聚糖酶的基因。本研究在KEGG通路中，該菌株注釋到的β-葡萄糖苷酶bglB和bglX分別屬于GH1和GH3家族，它們?cè)诶w維素降解中有重要作用。

2.2.3 纖維素代謝

KEGG通路注釋結(jié)果分析表明，共有290個(gè)基因和碳水化合物代謝相關(guān)，其中內(nèi)切葡聚糖酶(EC:3.2.1.4)和葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.20、EC:3.2.1.21)參與纖維素降解。為進(jìn)一步確定菌株JXNUWL7是否可以降解纖維素，通過(guò)纖維素培養(yǎng)基結(jié)合剛果紅染色法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該菌株能降解纖維素(圖7)。通過(guò)KEGG注釋結(jié)果分析菌株JXNUWL7的纖維素降解代謝相關(guān)基因并繪制出其主要的代謝通路(圖8)，對(duì)通路進(jìn)行分析可知菌株JXNUWL7可以降解纖維素，并通過(guò)糖酵解和三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)代謝生成的各類(lèi)中間產(chǎn)物進(jìn)一步參與氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝生成其他風(fēng)味和功能性物質(zhì)。根據(jù)對(duì)KEGG通路注釋結(jié)果中風(fēng)味物質(zhì)合成相關(guān)途徑分析的結(jié)果表明，該菌株可能通過(guò)莽草酸途徑生成各類(lèi)芳香族化合物，也可能通過(guò)丁酸代謝生成乙偶姻和丁二醇。與此同時(shí)，對(duì)脂肪酸代謝通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該菌株因缺少關(guān)鍵酶CPT1的編碼基因而無(wú)法代謝棕櫚酰輔酶A，但包含從乙酰輔酶A合成不飽和?；?[acp]的途徑。這說(shuō)明該菌株雖然對(duì)豆豉中粗脂肪的降解貢獻(xiàn)不大，但可能代謝生成中長(zhǎng)鏈風(fēng)味物質(zhì)，胡會(huì)萍等[19]所報(bào)道的和本研究一致。

圖7 JXNUXL7 對(duì)纖維素的利用Fig.7 Utilization of JXNUXL7 for cellulose

CelC-PTS系統(tǒng)，特定于纖維二糖的ⅡA組件；CelF-6-磷酸-β-葡萄糖苷酶；Pgm-磷酸葡萄糖變位酶；GalU-UTP-葡萄糖-l-磷酸尿苷基轉(zhuǎn)移酶；BglB/X-β-葡萄糖苷酶；AroH-分支酸變位酶；EntC-異分支酸合酶；EntB-雙功能異分支酸裂解酶；EntA-2,3-二氫-2，3-二羥基苯甲酸脫氫酶；DhbE-2,3-二羥基苯甲酸酯-AMP連接酶；DhbB-芳基載體蛋白；DhbF-非核糖體肽合成酶；TrpE-鄰氨基苯甲酸合酶組分Ⅰ；BioF-8-氨基-7-氧雜壬酸合酶；BioA-賴氨酸-8-氨基-7-氧雜壬酸氨基轉(zhuǎn)移酶；BioD-脫硫生物素合成酶；BioB-生物素合酶；IlB-乙酰 乳酸合酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ大亞基；AlsD-乙酰乳酸脫羧酶；ButA-丁二醇脫氫酶；Ldh-L-乳酸脫氫酶圖8 JXNUXL7纖維素代謝通路和相關(guān)風(fēng)味及功能性物質(zhì)形成通路Fig.8 Cellulose metabolism pathway and the related flaors and functional substances formation pathways in JXNUXL7

2.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

利用antismash軟件對(duì)樣本的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，一共有9個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，具體的預(yù)測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)表2。將菌株JXNUWL7所有基因簇與已知的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇做BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)功能已知的合成基因簇和5個(gè)功能未知的合成基因簇，這說(shuō)明菌株JXNUWL7基因組序列中可能存在新的活性物質(zhì)合成基因簇。羊毛硫抗生素是一類(lèi)作用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜上的熱穩(wěn)定抗菌肽[20]，可以作為抗菌藥物的替代品，地衣芽孢桿菌JXNUWL7基因組中羊毛硫抗菌肽基因簇(圖9)與抗生素基因簇K21 A1/K21 A2(lichenicidin K21 A1/K21 A2)相似性達(dá)到100%，可能作為羊毛硫抗生素合成開(kāi)發(fā)的目標(biāo)菌種。該菌種含有由13個(gè)基因組成的鐵載體基因簇，這些基因和芽孢桿菌類(lèi)微生物的耐鹽性能有關(guān)[21]。

表2 JXNUWL7次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測(cè)分析結(jié)果Table 2 Prediction and analysis results of secondary metabolite synthesis gene cluster of JXNUWL7

圖9 羊毛硫肽合成基因簇線性圖譜Fig.9 Linear map of lantipeptide synthesis gene cluster 注：圖譜展示預(yù)測(cè)基因簇中所有的基因，其中不同注釋基因的顏色采用該基因在COG分類(lèi)中的顏色的進(jìn)行顯示，不同顏色 代表的功能詳見(jiàn)COG分析界面，灰色代表該基因沒(méi)有注釋到COG

2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

對(duì)該菌株發(fā)酵大豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行GC-MS測(cè)定，主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量見(jiàn)電子增強(qiáng)出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030716)，地衣芽孢桿菌JXNUWL7發(fā)酵黑豆樣品中共鑒定出86種香氣成分，主要包含9種酯類(lèi)、6種醛類(lèi)、15種酮類(lèi)、7種吡嗪類(lèi)。以往研究表明，地衣芽孢桿菌在大曲中主要產(chǎn)生吡嗪類(lèi)、丁酸和丁酮類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)[22]，但本研究中地衣芽孢桿菌發(fā)酵豆豉還可以產(chǎn)生大量芳香酯和苯乙酮類(lèi)等對(duì)甜香和果香有重要貢獻(xiàn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這可能是由于豆豉發(fā)酵環(huán)境中富含蛋白質(zhì)。本研究對(duì)地衣芽孢桿菌JXNUWL7純種發(fā)酵豆豉進(jìn)行GC-MS分析結(jié)果表明，相對(duì)蒸煮黑豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分[23-24]而言，純種發(fā)酵黑豆吡嗪類(lèi)、芳香酯類(lèi)、苯乙酮、長(zhǎng)鏈酮類(lèi)和丁酸類(lèi)物質(zhì)增加，而正己醇和甲基麥芽酚含量大幅下降，且苯甲醛含量幾乎不變，這說(shuō)明黑豆中的正己醇和甲基麥芽酚可能被地衣芽孢桿菌代謝利用。

3 結(jié)論

本研究探討了菌株JXNUWL7基因組中可能涉及的糖苷酶種類(lèi)，地衣芽孢桿菌JXNUWL7可能產(chǎn)生包括β-葡萄糖苷酶在內(nèi)的66種碳水化合物活性酶，并含有豐富的纖維素代謝相關(guān)的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，具備完整的纖維素降解通路，這對(duì)于降解纖維素等糖苷類(lèi)物質(zhì)生成相應(yīng)的單糖，進(jìn)而通過(guò)糖酵解和三羧酸循環(huán)等途徑生成乙醇、乳酸、二磷酸尿苷葡萄糖等小分子物質(zhì)作為風(fēng)味物質(zhì)和功能性物質(zhì)前體具有重要作用，從而促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。同時(shí)，通過(guò)GC-MS和全基因組測(cè)序?qū)Φ匾卵挎邨U菌JXNUWL7單菌發(fā)酵大豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和分析，揭示出該菌株主要對(duì)豆豉芳香類(lèi)、吡嗪類(lèi)和中長(zhǎng)鏈酮類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)有重要貢獻(xiàn)，同時(shí)，解析出該菌株含有分支酸、乙偶姻、中長(zhǎng)鏈?；?[acp]等與風(fēng)味物質(zhì)合成相關(guān)的代謝途徑。從基因?qū)哟紊辖庾x了該菌株在豆豉發(fā)酵過(guò)程中的耐鹽和抗菌能力的原因。本研究通過(guò)全基因組學(xué)分析和GC-MS技術(shù)對(duì)地衣芽孢桿菌潛在的功能性基因進(jìn)行挖掘以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成進(jìn)行分析，為研究曲霉型豆豉發(fā)酵過(guò)程中功能微生物的代謝機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。