何步高 林傳輝 余關(guān)厚 利超媚 湯柏貴

駁骨止痛膏是本院資歷豐富的醫(yī)生經(jīng)過多年臨床試驗(yàn)總結(jié)而調(diào)配出的一種外用中藥制劑(粵藥制字Z20110161),功能是對跌打損傷具有較好的效果,成分由大黃、白芷、自然銅、當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)、姜黃、梔子、側(cè)柏葉、地黃、續(xù)斷、威靈仙、防風(fēng)等組成,將其研磨成粉末后加入油脂性基質(zhì)凡士林等調(diào)制成軟膏劑,主要作用是接骨續(xù)筋、理氣活血、消腫止痛等,用途為治療各種跌打損傷所致骨折、脫臼、筋傷,血瘀不散,腫脹疼痛等癥。為了達(dá)到制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)資料提高的要求,作者參照《中國藥典》2015 年版一部大黃、當(dāng)歸、姜黃項(xiàng)的鑒別方法［1］,借助于TLC 方法對藥材進(jìn)行鑒別,HPLC 方法測定姜黃素含量,結(jié)果較好。

1 材料與儀器

硅膠G 薄層板(10 cm×10 cm,0.25～0.3 mm,青島海洋化工有限公司),自制10 cm×10 cm 硅膠G 薄層板(0.3 mm),大黃對照藥材(批號：120984-201702),姜黃對照藥材(批號：121188-201703),當(dāng)歸對照藥材(批號：120927-201713),姜黃素對照品(批號：110823-201004)均購自中國食品藥品檢定研究院。高效液相色譜儀(美國戴安U3000),UV-1 型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。本院自制20180403、20180602和20180803 批次的駁骨止痛膏。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 大黃 供試品制備：稱取20 g 駁骨止痛膏于干凈容器內(nèi),倒入100 ml 75%甲醇,水浴加熱60℃溶解,超聲30 min 后冷卻,過濾濃縮到20 ml,加1 ml 鹽酸,再次水浴20 min,冷卻,加20 ml 乙醚混勻萃取2 次,合并乙醚液,水浴干燥直到變成殘?jiān)?之后加1 ml 甲醇溶解。

稱取大黃對照藥材0.5 g,按照相同步驟操作制備對照品。取一硅膠H 薄層板,將上述兩種樣品各6 μl 點(diǎn)到板上,放在裝有展開劑(石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸=15∶5∶1)的展開缸中展開,待展開適當(dāng)長度時(shí)取出,放在通風(fēng)櫥中晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,對照品和供試品在相應(yīng)的位置上有一相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 大黃TLC 圖

2.1.2 姜黃 供試品按照2.1.1 方法制備；稱取0.5 g姜黃對照藥材于干凈容器內(nèi),加5 ml 無水乙醇,超聲1 h,過濾收集濾液,濃縮到1 ml,作對照品。取一硅膠G 薄層板,將上述兩種樣品各6 μl 點(diǎn)到板上,放在裝有展開劑(三氯甲烷∶甲醇=40∶1)的展開缸中展開,待展開適當(dāng)長度時(shí)取出,放在通風(fēng)櫥中晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,對照品和供試品在相應(yīng)的位置上有一相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 姜黃TLC 圖

2.1.3 當(dāng)歸 供試品按照2.1.1 方法制備；稱取1 g當(dāng)歸對照藥材粉末于干凈容器內(nèi),加20 ml 乙醚,超聲20 min,過濾蒸干,加1 ml 甲醇溶解殘?jiān)?作對照品。取一硅膠G 薄層板,將上述兩種樣品各6 μl 點(diǎn)到板上,放在裝有展開劑(正己烷∶乙酸乙酯=4∶1)的展開缸中展開,待展開適當(dāng)長度時(shí)取出,放在通風(fēng)櫥中晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,對照品和供試品在相應(yīng)的位置上有一相同顏色的斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 當(dāng)歸TLC 圖

2.2 HPLC 測定姜黃素的含量

2.2.1 對照品制備 取一干凈的50 ml 量瓶,稱取10 mg 姜黃素對照品放入瓶中,先加少量的甲醇溶液將其溶解,之后繼續(xù)加到刻度線,搖勻,取1 ml 以上溶液到20 ml 的量瓶中,加甲醇補(bǔ)足到刻度,搖勻得到對照品儲備液,濃度為10.57 μg/ml。

取1 ml 對照品儲備液到10 ml 的量瓶中,同樣加甲醇到刻度線,搖勻得到對照品溶液,濃度為1.057 μg/ml。

2.2.2 供試品制備 稱取1.024 g 駁骨止痛膏到帶塞的錐形瓶中,倒入10 ml 甲醇稱重,然后60℃水浴超聲30 min,自然冷卻,再次稱重,加甲醇補(bǔ)足到初始重量,混勻,將以上液體過濾,使用直徑為0.45 μm 的濾膜,收集為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 取不含姜黃藥材的樣品,按照2.2.2 操作制備陰性對照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)考察 分別取10 μl 對照品、供試品和陰性對照溶液用高效液相色譜儀檢測。結(jié)果表明,供試品的保留時(shí)間和峰型與對照品一致,且陰性對照無干擾。見圖4。

圖4 HPLC 圖譜

2.2.5 線性關(guān)系 分別取姜黃素對照品儲備液0.2、0.6、1.0、2.0、3.0、5.0 ml 到10 ml 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為0.2114、0.6342、1.0570、2.1140、3.1710、5.2850 μg/ml 的溶液。各取10 μl 以上溶液注入高效液相色譜儀,按照2.2.4 操作測定,進(jìn)行回歸計(jì)算得回歸方程：Y=1.4044X-0.0780,r=0.9997。結(jié)果表明,進(jìn)樣量在0.002～0.05 μg 范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取10 μl 姜黃素對照品溶液,按照2.2.4 操作連續(xù)進(jìn)樣6 次,RSD 為0.65%,說明精密度很好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取駁骨止痛膏供試品溶液10 μl,在0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣,試驗(yàn)結(jié)果表明溶液穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取1 g 駁骨止痛膏,共5 份,按照2.2.2 方法制備,按照2.2.4 操作測定。結(jié)果：平均含量8.6597 μg/g,RSD 為0.88%,說明重復(fù)性很好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取駁骨止痛膏(批號：20180403,姜黃素含量8.6597 μg/g)0.5 g,共6 份,分別加入一定量的姜黃素對照品,按照2.2.2 方法制備,之后測定峰面積和計(jì)算姜黃素含量。見表1。

表1 姜黃素的加樣回收率

2.2.10 樣品含量測定 按照2.2.2 方法制備,取供試品和對照品溶液10 μl,計(jì)算樣品中姜黃素含量。見表2。

表2 姜黃素含量結(jié)果

3 小結(jié)

采用TLC 對駁骨止痛膏中的大黃［2］、姜黃［3］、當(dāng)歸［4］進(jìn)行定性鑒別,方法簡便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,可作為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量控制方法。HPLC測定駁骨止痛膏中姜黃素的含量,在驗(yàn)證精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率等方面均較好［5］。該方法可用于駁骨止痛膏的質(zhì)量控制。