頡 玙，張金梅，張 敏，雷 霆

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)測，全世界大約有4.15億成年人患有糖尿病，預(yù)計到2040年增長為6.42億[1]。糖尿病足(diabetic foot，DF)作為糖尿病最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制、巨大的醫(yī)療耗資以及難以治愈的臨床現(xiàn)狀，給患者家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。西醫(yī)治療DF以局部清創(chuàng)、手術(shù)修復(fù)為主，然而臨床療效不佳。中醫(yī)藥治療本病歷史悠久，中藥白及具有收斂止血、消腫生肌的功效，其性黏膩、收澀，外能消癰去死肌，內(nèi)可托潰排膿血，具有托舊生新之妙用[2]。三七是云南白藥的重要成分之一，具有祛瘀生新、止血定痛的作用[3]。使用白及三七藥對既可托舊生新，又能有效促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合，因此對于DF這種慢性難愈性疾病具有良好的修復(fù)效果。課題組前期研制的院內(nèi)制劑“白及膠/微米三七膏”臨床療效得到廣大患者的肯定。通過動物實驗及對腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎性因子的檢測，發(fā)現(xiàn)此藥確有抑制炎癥反應(yīng)的作用[4]，但局限在真實世界研究范疇，目前尚未有系統(tǒng)研究白及、三七治療DF作用機(jī)制的相關(guān)報道。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接法篩選出白及三七藥對有效成分、作用基因靶點及信號通路，進(jìn)一步明確其修復(fù)機(jī)制，為治療DF提供新的臨床思路。

1 資料與方法

1.1白及三七藥對化學(xué)成分篩選及靶點的獲取應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫、SymMap數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索白及、三七兩味中藥的所有化學(xué)成分及對應(yīng)靶點。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥物動力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME)參數(shù)，以其中化學(xué)成分的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug like index，DL)≥0.18和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中以靶點分值score≥20作為閾值篩選以上中藥化合物[5-7]作為候選化合物。

1.2DF已知治療靶點和中藥-疾病共同靶點的獲取 通過毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(CTD)、人類孟德爾遺傳研究平臺(OMIM)和人類基因信息數(shù)據(jù)庫(GeneCards)搜集DF相關(guān)疾病靶點，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫以關(guān)聯(lián)系數(shù)(Score≥5)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，所得靶點即為DF已知治療靶點。并將化合物作用靶點與疾病靶點取交集，通過Omicshare進(jìn)行在線Venn圖可視化，獲取白及三七藥對治療DF的共有靶點。

1.3構(gòu)建蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI) 使用Perl軟件(V5.26.3)在Uniprot[8]數(shù)據(jù)庫中為活性化合物對應(yīng)關(guān)鍵靶點添加基因號及標(biāo)準(zhǔn)化命名，將共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，默認(rèn)置信度大于0.7，利用可視化軟件Cytoscape 3.6.0的cytoHubba插件對網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析，以自由度(Degree)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選出排名前30的Hub基因并繪制蛋白頻次條形圖。

1.4構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape 3.6.0軟件，將白及三七藥物、成分、靶點之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化處理。

1.5白及三七藥對治療DF預(yù)測靶點富集分析利用cluster profile R包對核心靶點進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組合百科全書(KEGG)通路分析，GO功能注釋包括細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)、生物學(xué)過程(Biological Process，BP)及分子功能(Molecular Function，MF)。KEGG富集分析主要用于分析在行使生物學(xué)功能時差異表達(dá)基因可能通過的信號通路；其中，以P<0.05值作為篩選指標(biāo)。

1.6核心活性成分與核心靶點的分子對接 從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nl m.nih.gov/)下載核心活性成分的2D結(jié)構(gòu)，通過ChemOffice軟件轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)并以mol2格式保存。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Protein Date Bank，PDB)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點PDB格式的3D結(jié)構(gòu)，運用PyMOL軟件對靶蛋白移除配體和非蛋白分子等操作，利用AutoDock 1.5.6 軟件將活性成分及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運行Auto dock vina進(jìn)行分子對接，再使用PyMOL對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1白及三七藥對化學(xué)成分篩選及靶點的獲取將白及、三七兩味中藥上傳至TCMSP、SymMap和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，初步檢索共得到4 470個活性化合物，按照OB≥30%、DL≥0.18和BATMAN-TCM(score≥20)的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選出了209個活性化合物，對所有化合物去重并刪除無效化合物，最終得到102個活性化合物，其中三七84個、白及18個，共對應(yīng)1 261個靶基因，見表1。

表1 白及三七藥對活性成分

續(xù)表

續(xù)表

2.2DF的已知治療靶點篩選 從OMIM、Genecards、CTD數(shù)據(jù)庫中檢索DF相關(guān)靶點，從OMIM中檢索出52個靶點，由于該數(shù)據(jù)庫中靶點較少，在后續(xù)分析中僅用Genecards和CTD數(shù)據(jù)庫篩選得到的交集用于后續(xù)分析。CTD中檢索到3 726個靶點， Genecards中檢索出Score≥5的1 534個靶點，求兩者交集得到529個靶點，見圖1。

圖1 糖尿病足潛在靶點基因

2.3白及三七藥對和DF的共有靶點的獲取 將疾病靶點與白及三七藥對活性成分作用靶點取交集，通過Omicshare進(jìn)行在線Venn圖可視化，可得到共有靶點有164個，見圖2及表2。

圖2 白及三七藥對活性成分-糖尿病足疾病靶點韋恩圖

表2 白及三七藥對藥物-糖尿病足共有靶點

續(xù)表

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點的篩選 基于String數(shù)據(jù)庫得出164個共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)，再用“cytoHubba”插件對網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析，以自由度(Degree)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊蠛Y選排名前30的Hub基因繪制蛋白頻次條形圖，這30個靶點相比其他靶點相互作用更強(qiáng)，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，且更可能成為治療DF的核心靶點(見圖4)。

圖3 白及三七藥對-糖尿病足共有靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 白及三七藥對-糖尿病足共有靶點排名前30的Hub基因蛋白頻次條形圖

2.5“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖 將藥物、成分、靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5)，共257個節(jié)點(藥物2個，核心活性成分91個，靶點164個)，723個邊。結(jié)果顯示：Quercetin(槲皮素，Degree=74)、coprine(鬼傘菌素，Degree=26)，Dicapryl Phthalate(鄰苯二甲酸二正辛酯，Degree=20)，3,4-Dimethylbenzoic Acid(3,4-二甲基苯甲酸，Degree=20)、Hexadecanoic Acid(棕櫚酸，Degree=18)等化合物在整個網(wǎng)絡(luò)中起重要的作用。

圖5 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.6GO和KEGG通路分析 GO富集分析結(jié)果顯示，白及三七藥對的主要活性成分對應(yīng)的164個共有靶點，主要涉及細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子功能；細(xì)胞組分方面主要涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等；生物過程方面主要涉及脂多糖調(diào)節(jié)、營養(yǎng)水平的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝過程等(見圖6)。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，與白及三七藥對治療DF的相關(guān)靶標(biāo)具有顯著相關(guān)性的信號通路主要有AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等(見圖7)，圖8為AGE-RAGE通路分析圖。

圖6 GO功能注釋

圖7 KEGG 代謝通路圖

圖8 AGE-RAGE信號通路

2.7分子對接結(jié)果 根據(jù)“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值可分別得到具有相關(guān)性的核心活性成分及其核心作用靶點。對其分析后認(rèn)為核心活性成分為槲皮素、鬼傘菌素、3,4-二甲基苯甲酸、鄰苯二甲酸二正辛酯，核心作用靶點為TNF、TP53、NOS3、IL-6。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-4.25kcal/mol提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，小于-5.0kcal/mol有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[9]。根據(jù)分子對接結(jié)果(見表3)，除了鄰苯二甲酸二正辛酯與IL-6結(jié)合能較高外，槲皮素、鬼傘菌素、3,4-二甲基苯甲酸與其核心靶蛋白結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，說明白及三七藥對的核心活性成分與其靶蛋白能形成穩(wěn)定的結(jié)合，同時驗證了白及三七藥對對DF的確有治療作用。利用Pymol軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見圖9)。

表3 白及三七藥對主要活性成分-作用靶點分子對接結(jié)合能

圖9 分子對接模式圖

3 討 論

本次研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接法預(yù)測白及三七藥對修復(fù)DF的機(jī)制，得到了102個主要活性化合物，164個藥物-疾病共有靶點，5 597條生物過程和273條信號通路，這些結(jié)果能夠體現(xiàn)出白及、三七在治療DF過程中的潛在修復(fù)作用機(jī)制。

從所得活性成分結(jié)果可知，槲皮素、鬼傘菌素、鄰苯二甲酸二正辛酯、3,4-二甲基苯甲酸、棕櫚酸等成分在“藥物-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。其中槲皮素具有抗氧化、參與免疫調(diào)節(jié)及抗炎等作用[10-11]。主要通過提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能影響細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌[12]，能治療心血管疾病、糖尿病及癌癥等[13-14]。鬼傘菌素是藥用菌毛頭鬼傘的主要成分，研究證明鬼傘菌素能夠通過增加胰島素的釋放，保護(hù)胰島細(xì)胞不被入侵，提高抗氧化活性，調(diào)節(jié)代謝途徑，從而起到減少炎癥反應(yīng)的作用[15]。鄰苯二甲酸二正辛酯可通過氧化應(yīng)激途徑引起胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)Ⅱ型糖尿病[16]。苯甲酸類藥能夠促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素，并且能夠降低胰高血糖素的含量，具有明顯的降糖作用[17]。棕櫚酸可隨著其濃度的升高導(dǎo)致炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)和分泌增加，從而加劇炎癥反應(yīng)[18]。由此推測白及三七藥對可通過多種活性成分、多種途徑抑制炎癥反應(yīng)、降低血糖而改善DF。

從藥物-疾病共有靶點及核心靶點篩選結(jié)果可知，IL-6、TP53、IL-1β、TNF、NOS3、IGF1、EDN1、CCL2等在網(wǎng)絡(luò)中更具顯著性。IL-6是最常見的炎性因子之一，主要成分為單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞，與內(nèi)分泌關(guān)系密切，已有研究證明其與糖尿病并發(fā)癥之間關(guān)系密切[19]。TP53是重要的腫瘤抑制蛋白之一，可在細(xì)胞周期依賴性激酶誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷環(huán)節(jié)起到抑制作用，促使細(xì)胞周期停留在G1期，最終加速細(xì)胞凋亡[20]。TNF能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷血管內(nèi)皮或?qū)е卵芄δ芪蓙y，造成局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死[21]。NOS3、IGF1均可作用于血管內(nèi)皮，NOS3又稱內(nèi)皮型一氧化氮合酶，已有研究證實[22]，NOS3、IGF-1信號通路均有促進(jìn)創(chuàng)面的血管生成，最終起到愈合創(chuàng)面的作用[23]。姜懿納等[24]在論述CCL2與糖尿病關(guān)系時指出，在高濃度的血糖和三酰甘油環(huán)境下，CCL2啟動子區(qū)域的CpG位點可以增加血清中CCL2的含量，從而容易誘發(fā)2型糖尿病血管并發(fā)癥。由此推測白及三七藥對通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、抗細(xì)胞凋亡、促血管內(nèi)皮生成、參與免疫調(diào)節(jié)等多靶點協(xié)同作用發(fā)揮治療DF的作用。

富集分析結(jié)果顯示，在靶點富集的前15條通路中，與白及三七藥對治療DF的相關(guān)靶標(biāo)具有顯著相關(guān)性的信號通路主要為AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等。AGEs與RAGE結(jié)合后會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)通過激活絲裂原活化蛋白(MAP)激酶等途徑激活NF-κB，NF-κB的活化可以刺激促氧化基因表達(dá)，從而導(dǎo)致NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增加，如此形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致潰瘍創(chuàng)面難以愈合[25]。向延衛(wèi)等[26]通過實驗明確指出，MAPK信號通路在治療糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著重要作用。MAPKs能夠調(diào)控多種細(xì)胞運動，并且能夠參與細(xì)胞骨架蛋白的合成，故可參與傷口的愈合過程[27]。在HIF-1信號通路中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是其最典型的靶基因之一。實驗發(fā)現(xiàn)[28]，在糖尿病患者的下肢皮膚中，HIF-1和VEGF的表達(dá)是降低的，因此患者血管內(nèi)皮細(xì)胞生長功能會受到損傷，此為創(chuàng)面易形成的因素之一。且血管主要是在低氧誘導(dǎo)的環(huán)境下的生成的，而HIF-1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對低氧的反應(yīng)，因此在DF創(chuàng)面血管生成中起到了至關(guān)重要的作用[29]。分子對接技術(shù)在已預(yù)測出的核心成分與核心靶點的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選得到匹配程度更高的4種成分與4個靶點，驗證了白及三七藥對的核心活性成分能夠與靶基因穩(wěn)定結(jié)合，為后續(xù)從白及三七藥對中提取有效藥物成分治療DF提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)。由此推測白及三七藥對修復(fù)DF是基于多條通路并與細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子功能和氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧代謝等生物過程密切相關(guān)，預(yù)測結(jié)果與已知研究相符，提示本研究所預(yù)測靶點及信號通路的可行性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對白及三七藥對修復(fù)DF的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明白及三七藥對治療DF的有效成分是槲皮素、鬼傘菌素、鄰苯二甲酸二正辛酯、3,4-二甲基苯甲酸等，這些成分通過調(diào)節(jié)TNF、TP53、NOS3、IL-6等蛋白，作用于AGE-RAGE、MAPK、HIF-1等信號通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、抗細(xì)胞凋亡、促血管內(nèi)皮生成、參與免疫調(diào)節(jié)等作用，從而達(dá)到治療疾病的效果。本文初步探索了白及三七藥對修復(fù)DF的機(jī)制，為體內(nèi)實驗提供了新的思路，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法仍具有一定的局限性，因此課題組將通過實驗研究對白及三七藥對治療DF的作用機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。