李晶晶，陳 穎，王 陽，徐道立，劉春暉，王汝芹，佟 慶

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3. 武漢同濟航天城醫(yī)院，湖北 武漢 431400；4. 廊坊市中醫(yī)院，河北 廊坊 065000)

外陰慢性單純性苔蘚(vulvar lichen simplex chronicus，VLSC)是發(fā)生于外陰皮膚的一種良性的慢性炎癥性皮膚疾病，該病以外陰瘙癢難忍為主要臨床表現(xiàn)，因其產(chǎn)生的瘙癢癥狀持續(xù)反復(fù)發(fā)作，會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前研究認(rèn)為VLSC可能是一種免疫功能失調(diào)性疾病，但具體的發(fā)病機制仍不明確[3-5]?，F(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家認(rèn)為VLSC發(fā)病原因多與濕、熱、燥、風(fēng)邪相關(guān)，涉及肝、腎、心、脾、肺，與肝腎二臟關(guān)系最為密切[6]。中醫(yī)治療多采用口服中藥、中藥外洗、針灸及穴位注射等[7]，但作用機制不明確，一直處于探索階段。歸芪藤草湯是國家級名老中醫(yī)金哲教授治療VLSC的經(jīng)驗方，該方以“血虛濕蘊”為立論基礎(chǔ)，臨床研究顯示該方治療有效率在80%以上[8]。本實驗通過建立VLSC大鼠模型，觀察了歸芪藤草膏對外陰組織、肝腎功能及Th1/Th2免疫機制的影響，旨在闡釋VLSC的發(fā)病機制及歸芪藤草膏的可能治療靶點。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6～7周齡雌性SD大鼠40只，體重160～180 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號： SCXK(京) 2019-0010。于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物實驗中心，在干燥、無菌、空氣流通、24 h光暗循環(huán)條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)，常規(guī)喂食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。該實驗操作符合動物倫理要求。

1.2主要藥品及試劑 歸芪藤草膏(由當(dāng)歸15 g、生黃芪30 g、藤梨根15 g、老顴草15 g、川芎10 g、蛇床子10 g、仙鶴草15 g、紫草10 g、薄荷6 g、透骨草15 g組成)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室統(tǒng)一熬成膏，藥劑室進(jìn)行質(zhì)量控制，將制成的歸芪藤草膏于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二甲基苯并?DMBA，美國Sigma 公司)，分析純丙酮液(國藥集團化學(xué)制劑有限公司)，甲苯胺藍(lán)(北京化學(xué)試劑公司)，4%多聚甲醛固定液(北京華奧生物)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(均為武漢云克隆科技股份有限公司)。

1.3實驗方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機取10只作為空白組，其余30只參照文獻(xiàn)[9-10]方法進(jìn)行造模：充分暴露大鼠外陰，用固定的硬毛牙刷刷大鼠外陰皮膚，刷至皮膚充血發(fā)紅后，用勾線筆蘸0.5% DMBA丙酮溶液適量涂布于外陰皮膚，待其自然晾干后放回代養(yǎng)籠常規(guī)飼養(yǎng)。每周均于周一、周三、周五固定的時間給予處理，共處理8周，后自然觀察2周。自然觀察結(jié)束后的周日，以1%戊巴比妥鈉溶液按照80 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，用1%甲苯胺藍(lán)溶液涂抹于外陰皮膚，晾干后用1%冰醋酸進(jìn)行脫色，在不脫色處用皮膚鉆環(huán)鉆鉆取皮膚組織，組織以4%多聚甲醛組織固定液固定、脫水、石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片，HE染色后行光鏡下觀察，見慢性單純苔蘚樣改變即為造模成功。將造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為歸芪藤草膏組和模型組，每組13只。之后模型組給予蒸餾水外涂外陰，歸芪藤草膏組給予歸芪藤草膏外涂外陰(厚度約l mm，藥物停留30 min)，涂抹后大鼠單籠放置，均每日1次，連續(xù)4周；空白組不給予任何干預(yù)。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1外陰皮膚組織觀察 最后一次干預(yù)2 h后,肉眼觀察各組大鼠外陰皮膚情況；然后將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，用1%甲苯胺藍(lán)溶液涂抹于外陰皮膚，干燥后用1%冰醋酸擦洗脫色，在不脫色區(qū)用皮膚鉆鉆取組織，組織以4%多聚甲醛組織固定液固定、脫水、石蠟包埋、 4 μm厚連續(xù)切片，HE染色后行光鏡觀察。

1.4.2血液學(xué)指標(biāo)檢測 鉆取外陰皮膚組織后，分離腹主動脈，取血液，3 000 r/min離心20 min后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采用 ELISA 法檢測血清中AST、ALT、BUN、SCr、IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-6水平，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠外陰肉眼觀察表現(xiàn) 空白組大鼠外陰皮膚顏色淡紅，彈性良好。模型組大鼠于蒸餾水干預(yù)前較正常組大鼠皮膚顏色較紅，觸診皮膚明顯粗糙，彈性降低；蒸餾水外涂4周后皮膚顏色與干預(yù)相比未見明顯改變，皮膚觸診仍較為粗糙，彈性差。歸芪藤草膏組大鼠干預(yù)4周后皮膚顏色明顯較模型組好轉(zhuǎn)，觸診皮膚光滑有彈性，與空白組大鼠外陰皮膚外觀大致相同。見圖1。

圖1 空白組和外陰慢性單純性苔蘚各組大鼠外陰皮膚表現(xiàn)

2.2各組大鼠外陰皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn) 鏡下見空白組大鼠外陰皮膚組織層次清楚，復(fù)層角化鱗狀上皮細(xì)胞排列整齊，極性保持，基底層細(xì)胞明顯；模型組大鼠復(fù)層鱗狀上皮增生，角化層增厚，表皮角化過度，上皮層次增多，真皮層膠原纖維化并伴有炎細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列整齊，極性保持，基底層細(xì)胞明顯；歸芪藤草膏組92.3%(12/13)的大鼠外陰皮膚已經(jīng)恢復(fù)正常，鏡下見復(fù)層角化鱗狀上皮，上皮細(xì)胞排列整齊，極性保持，基底層細(xì)胞明顯。見圖2。

圖2 空白組和外陰慢性單純性苔蘚各組大鼠外陰皮膚組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr水平比較模型組大鼠血清AST、BUN水平和歸芪藤草膏組大鼠血清BUN水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，歸芪藤草膏組大鼠血清ALT、AST水平均明顯低于空白組(P均<0.05)；歸芪藤草膏組大鼠血清ALT、AST、BUN水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；各組大鼠血清SCr水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和外陰慢性單純性苔蘚各組大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr水平比較

2.4各組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平比較 模型組大鼠血清IL-2 、IL-4、IL-6水平和歸芪藤草膏組大鼠血清IL-4和IL-6水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，模型組大鼠血清IFN-γ水平和歸芪藤草膏組大鼠血清IL-2、IFN-γ水平均明顯低于空白組(P均<0.05)；歸芪藤草膏組大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，血清IFN-γ水平明顯高于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 空白組和外陰慢性單純性苔蘚各組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)VLSC臨床表現(xiàn)認(rèn)為其屬于“陰瘡”“陰癢”“陰痛”“狐惑”等范疇?！吨夂髠浼狈健ぞ砦濉罚骸瓣幇W汁出，嚼生大豆黃，涂之，亦療尿灰瘡?！薄吨T病源候論·婦人雜病諸候》曰:“腎榮于陰器,腎氣虛,不能制津液,則汗?jié)?虛則為風(fēng)邪所乘,邪客腠理,而正氣不泄,邪正相干,在于皮膚,故癢，搔之則生瘡?！薄夺t(yī)宗金鑒》記載“郁熱傷損肝脾，氣血凝滯，濕熱下注，久而蟲生所致”?，F(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家多認(rèn)為VLSC發(fā)生的主要內(nèi)因是肝腎不足、血虛精虧，血虛風(fēng)燥、脈絡(luò)瘀阻是主要病機[11]。一項系統(tǒng)性評價研究認(rèn)為，中藥外用治療外陰白色病變的療效優(yōu)于西藥外用，治療后復(fù)發(fā)率也更低[12]。且中藥局部外敷可使藥物通過局部皮膚直接滲透和吸收，改善局部血液循環(huán)，具有不經(jīng)過肝臟的“首過效應(yīng)”和胃腸道破壞的優(yōu)勢，作用時間長，使用方便。

歸芪藤草膏從養(yǎng)血祛濕入手，方用當(dāng)歸養(yǎng)血活血潤燥，藤梨根清熱解毒、祛風(fēng)除濕，兩藥共用，清濕毒而不傷正，養(yǎng)血氣而不留邪，共為君藥。生黃芪補中益氣，托里透毒，使有形之血不易速生；老顴草屬肝經(jīng)，環(huán)陰器而通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)濕以散結(jié)；川芎活血通經(jīng)，配合當(dāng)歸通利肝經(jīng)血脈；三藥共用加強君藥養(yǎng)血祛濕之功。佐以蛇床子溫陽氣、祛風(fēng)除濕、殺蟲止癢，仙鶴草、紫草清熱解毒，薄荷引藥直達(dá)病所，提高全方透皮滲透吸收作用。全方養(yǎng)血氣、祛風(fēng)燥、利濕毒，標(biāo)本兼治，使外陰得以滋養(yǎng)，肌肉得以充實，腠理更加致密，則瘙癢消散，外陰色澤恢復(fù)如常[13]。本實驗結(jié)果顯示，外用歸芪藤草膏外用4周后，大鼠外陰組織HE染色見復(fù)層角化鱗狀上皮，上皮細(xì)胞排列整齊，極性保持，基底層細(xì)胞明顯，基本恢復(fù)正常，證實歸芪藤草膏可明顯改善VLSC大鼠皮膚損害。

AST、ALT是反映肝功能的重要指標(biāo)，BUN、SCr是反映腎功能的重要指標(biāo)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清AST、BUN水平和歸芪藤草膏組大鼠血清BUN水平均較空白組明顯升高；歸芪藤草膏組大鼠血清ALT、AST、BUN水平均較模型組明顯降低，且血清ALT、AST水平明顯低于空白組；各組大鼠血清SCr水平差異不明顯。提示VLSC大鼠的肝腎指標(biāo)發(fā)生了一些變化，歸芪藤草膏在一定程度上可影響大鼠的肝腎功能。查閱眾多文獻(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)VLSC發(fā)病與肝腎功能關(guān)系的研究。究其原因，可能為VLSC本身為婦科與皮膚科的交叉病種，其所受的關(guān)注度較低；其次，VLSC作為外陰局部疾病，對于肝腎的影響并不甚顯著。

輔助性 T 細(xì)胞在炎癥性疾病的發(fā)病中起著非常重要的作用，其主要通過分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他類型免疫細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)功能[14]。根據(jù)細(xì)胞因子的分泌模式，輔助性T細(xì)胞可分為Th1和Th2亞群,Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,并介導(dǎo)細(xì)胞免疫,如激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)；Th2主要分泌IL-4、IL-6等細(xì)胞因子,并介導(dǎo)體液免疫,如激活B細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞[15]。正常機體內(nèi),Th1/Th2網(wǎng)絡(luò)維持著動態(tài)平衡，若Th1/Th2的平衡遭到破壞,即可引起機體的異常免疫,導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。 VLSC是慢性單純性苔蘚(神經(jīng)性皮炎)的一種特殊類型，有研究表明,神經(jīng)性皮炎的發(fā)生可能與Th1/Th2失衡有關(guān)，Th2參與了皮損的炎癥反應(yīng)[14]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平和歸芪藤草膏組大鼠血清IL-4和IL-6水平均較空白組高，模型組大鼠血清IFN-γ水平和歸芪藤草膏組大鼠血清IL-2、IFN-γ水平均較空白組低；歸芪藤草膏組大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平均明顯低于模型組，血清IFN-γ水平明顯高于模型組。說明VLSC大鼠存在著血清IL-2、IL-4、IL-6水平升高及IFN-γ水平降低的現(xiàn)象，而歸芪藤草膏可下調(diào)VLSC大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平和上調(diào)血清IFN-γ水平，但并無明顯地向Th1或者Th2偏移，提示 VLSC的發(fā)生確實存在著某些炎性因子的改變，但是否存在Th1/Th2失衡需要進(jìn)一步論證。

綜上所述，歸芪藤草膏能顯著改善VLSC大鼠外陰皮膚病變，其作用機制可能與調(diào)節(jié)大鼠肝腎功能及Th1、Th2相關(guān)炎性因子水平相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。