上官豪，徐 維，陳劍豪，黃煉紅，葛舒穎，陳可愛，蘇清平，張愛香

(1. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005)

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)，發(fā)病后由于大腦血液及氧氣供應(yīng)迅速減少，立即出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、裂解、細(xì)胞器游離等[1-2]。在腦缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，通過電鏡可觀察到線粒體損傷，表現(xiàn)為形態(tài)損害、腫脹[3-4]。近年來，鐵死亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用受到廣泛關(guān)注，眾多學(xué)者通過對腦缺血損傷動(dòng)物模型研究證實(shí)缺血性腦卒中可誘發(fā)鐵死亡介導(dǎo)神經(jīng)損傷[5-6]。因此，抑制鐵死亡可改善腦缺血后神經(jīng)損傷。電針結(jié)合了針灸和電生理刺激的優(yōu)點(diǎn)，且具有簡、便、廉、效的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于腦缺血的臨床治療。曲池、足三里穴分別為手足陽明經(jīng)合穴，具有多氣、多血的特點(diǎn)，是治療中風(fēng)較常用的2個(gè)穴位[7]。課題組前期研究表明電針曲池、足三里穴可縮小局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)[8-9]，但是目前對其作用機(jī)制的認(rèn)識還不十分清楚，很有必要從新視角深入探討其改善腦缺血后神經(jīng)損傷的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)探討了電針曲池、足三里穴是否可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠36只，體重(250±30)g，購于上海斯萊克動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)條件：溫度21～25 ℃，濕度60%～70%，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，自由飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照《中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法》進(jìn)行，并獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器 2%戊巴比妥鈉(美國Sigma)，TTC染色液體(2,3,5-Tripheny Tetrazolium Chloride，北京索萊寶科技有限公司)，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司)，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)；MCAO線栓(L3200，廣州佳靈)，G6805型電針儀(上海華誼公司)，超薄切片機(jī)(EM UC7,Leica Microsystems, Germany)，透射電子顯微鏡(H-7650, Hitachi, Japanese)，超凈工作臺。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將36只大鼠編號，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組及電針組，每組12只。術(shù)前禁食，室溫22 ℃條件下，模型組及電針組制備腦缺血損傷模型：采用2%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，取頸前正中2 cm縱向切口，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈及其分支，結(jié)扎頸外動(dòng)脈及近心端頸總動(dòng)脈。用微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈后，在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口，并將已備好的MCAO線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，順勢推送至大腦中動(dòng)脈起始部，從分叉處插入18～22 mm，造成腦缺血。缺血2 h后，回抽線栓約10 mm，恢復(fù)灌注。假手術(shù)組僅分離左側(cè)血管，不插線栓。判定造模成功后，電針組大鼠于術(shù)后第1天開始干預(yù)：捆綁法固定，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]取大鼠患肢曲池穴(定位于橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中)、足三里穴(定位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處)，消毒后，用華佗牌30號0.5寸針，斜刺0.2～0.3 cm，接G6805電針儀，選擇疏密波，頻率2/20 Hz，刺激以患體輕微抖動(dòng)為度，30 min/次，1次/d，干預(yù)7 d；模型組及假手術(shù)組大鼠同等方法抓取固定30 min，但不電針干預(yù)。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1神經(jīng)功能 干預(yù)7 d后，由1名對本實(shí)驗(yàn)不知情的觀察員，采用mNSS神經(jīng)功能缺損評分[11]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估，主要觀察大鼠的運(yùn)動(dòng)(肌肉情況、異常行動(dòng))、感覺(視、觸、本體覺)、平衡、神經(jīng)反射和整體表現(xiàn)。

1.4.2腦梗死體積 干預(yù)7 d后，每組隨機(jī)取大鼠6只，采用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，快速取腦組織，經(jīng)冷凍后，沿冠狀面切成2 mm厚的薄片(4～5片)，薄片置于配置好的TTC染色液中，37 ℃避光孵育15～30 min。梗死部分不著色，未梗死區(qū)域被染成紅色。將腦組織切片拍照后，應(yīng)用Image J圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)腦組織腦梗死的總體積，計(jì)算腦梗死體積百分比(梗死體積/全腦體積×100%)。

1.4.3線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu) 干預(yù)7 d后，每組隨機(jī)取大鼠6只，采用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，4%多聚甲醛行心臟灌流固定后，快速取腦，分離左缺血周圍區(qū)皮質(zhì)(1～2 mm3)，置入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d(4 ℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定2 h，磷酸鹽緩沖液漂洗；經(jīng)梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋。超薄切片(80 nm)，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，采用H-7650型電鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)并攝影。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠mNSS神經(jīng)功能缺損評分比較 干預(yù)7 d后，模型組和電針組大鼠mNSS評分分別為(9.92±1.31)分和(7.42±1.31)分，電針組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)組大鼠無梗死發(fā)生；模型組大鼠腦梗死體積百分比為(23.20±3.24)%，電針組為(17.46±3.35)%，電針組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體(箭頭標(biāo)記為線粒體)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷嚴(yán)重，形態(tài)結(jié)構(gòu)萎縮，線粒體膜密度增加，嵴明顯減少或消失，典型的鐵死亡表現(xiàn)；與模型組比較，電針組大鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)明顯改善，呈輕度損傷，形態(tài)趨于正常，膜密度減小，嵴數(shù)目增加。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和局灶性腦缺血大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，×25 000)

3 討 論

腦卒中又叫中風(fēng)，屬于中醫(yī)學(xué)“偏枯”“偏癱”范疇，主要臨床癥狀為猝然昏倒、不省人事、半身不遂等。清代醫(yī)家王清任認(rèn)為中風(fēng)偏癱的本源是“半身不達(dá)，虧損元?dú)狻?，元?dú)馓潛p大半，半身經(jīng)絡(luò)空虛而無血?dú)忮︷B(yǎng)，則半身不能動(dòng)用，發(fā)為偏癱。因此治療當(dāng)以補(bǔ)氣活血、疏通經(jīng)絡(luò)為主。《素問·痿論》提出“治痿獨(dú)取陽明”的治法。曲池、足三里穴為陽明經(jīng)之合穴，具有主潤宗筋、通經(jīng)絡(luò)、調(diào)氣血作用。《針灸大成》明確記載“半身不遂、中風(fēng)：絕骨、昆侖、合谷、肩髃、曲池、手三里、足三里”。因此針灸曲池、足三里穴是治療中風(fēng)的有效方法之一。臨床研究表明針灸曲池、足三里穴治療缺血性腦卒中療效顯著且安全[12-13]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明電針曲池、足三里穴可減輕缺血性腦卒中后的神經(jīng)損傷，縮小腦梗死體積，減輕腦水腫[14-16]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

鐵死亡是一種新型程序性死亡，其特征是鐵依賴性的、以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)致活性氧積累導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[17]。鐵死亡通過使細(xì)胞膜上含不飽和脂肪酸長鏈的磷脂分子脂質(zhì)過氧化，引起膜氧化損傷、破裂，致細(xì)胞死亡，形態(tài)學(xué)上鐵死亡的典型特征為線粒體凝結(jié)或腫脹、膜密度增加、嵴減少或消失等[18]。近年研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡參與了缺血性腦卒中的發(fā)病，Li等[19]通過透射電鏡觀察到腦缺血神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵死亡特征性線粒體改變。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)腦缺血模型組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷嚴(yán)重，形態(tài)結(jié)構(gòu)萎縮，膜密度增加，嵴明顯減少或消失，表明腦缺血損傷中皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。因此，考慮腦缺血損傷可能通過誘發(fā)鐵死亡介導(dǎo)神經(jīng)功能損傷。Tuo等[20]證實(shí)缺血性腦卒中導(dǎo)致腦組織鐵離子明顯升高，并通過鐵死亡途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，而鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1或Ferrostatin-1治療可改善神經(jīng)損傷，提示抑制鐵死亡可能具有一定神經(jīng)保護(hù)作用。Tang等[21]發(fā)現(xiàn)針灸干預(yù)可抑制鐵死亡、氧化應(yīng)激起到抗炎保護(hù)作用。Li等[22]和Kong等[23]研究發(fā)現(xiàn)針灸可抑制腦出血大鼠神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡，改善神經(jīng)功能。Li等[19]發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)、水溝、雙側(cè)三陰交和雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴可以通過抑制鐵死亡預(yù)防腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而減輕神經(jīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)電針缺血性腦卒中大鼠曲池、足三里穴可抑制鐵死亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡表現(xiàn)。

綜上所述，鐵死亡介導(dǎo)了腦缺血后的神經(jīng)損傷，鐵死亡機(jī)制可能成為缺血性腦卒中治療的新靶點(diǎn)。電針曲池、足三里穴可改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，縮小梗死體積，保護(hù)腦神經(jīng)，機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡有關(guān)，但其具體的效應(yīng)機(jī)制有待深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。