劉志紅,劉 靜,孟令振,魯 明,王瑞英

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種排除乙醇和其他明確原因?qū)е赂谓M織脂肪過度沉積為特征的疾病，如不有效控制，約40%的患者可進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎[1]。目前研究認(rèn)為NAFLD是代謝綜合征的危險(xiǎn)因素，與2型糖尿病、肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)[2]?？刂骑嬍场p輕體重和運(yùn)動(dòng)雖然可以減輕或逆轉(zhuǎn)NAFLD，但患者難以長時(shí)間堅(jiān)持，因此，需要開發(fā)新的治療藥物和鑒定新的治療靶點(diǎn)。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，在紅葡萄、藍(lán)莓、花生等多種植物中廣泛存在，其具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗癌、抗衰老等多種作用，且被證實(shí)可有效減輕NAFLD小鼠肝臟病變程度[3-4]。Notch 基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程，當(dāng)Notch基因表達(dá)異常時(shí)，機(jī)體代謝發(fā)生紊亂，會(huì)引起胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂及肥胖等，從而導(dǎo)致包括NAFLD在內(nèi)的多種疾病發(fā)生[5-6]。本實(shí)驗(yàn)觀察了白藜蘆醇對(duì)NAFLD小鼠肝脂肪變性及Notch信號(hào)通路的影響，旨在進(jìn)一步明確其作用及可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠40只，體重21.0～23.0 g，購于北京維通利華公司，合格證號(hào)：SCXK (京)2016-0006。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，12/12 h日/夜光照循環(huán)屏障動(dòng)物房中。

1.2藥品與試劑 白藜蘆醇(美國Sigma公司)?？偰懝檀?TC)及三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量預(yù)混試劑(北京天根生化科技有限公司)；兔抗鼠Notch1抗體(Abcam公司)。

1.3儀器 Multiskan FC型酶儀(美國Thermo公司)；LEICA 819切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；DYY-Ⅲ型穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；GDS8000凝膠成像儀(美國UVP公司)；PCR儀(美國 Thermo 賽默飛世爾科技公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 選取10 只 C57BL/6J 雄性小鼠作為正常組，實(shí)驗(yàn)過程中給予普通飼料(20%蛋白質(zhì)、70%碳水化合物、10%脂肪)喂養(yǎng)；余30只C57BL/6J 雄性小鼠給予高脂飼料(20%蛋白質(zhì)、20%碳水化合物、60%脂肪)喂養(yǎng)12周建立NAFLD模型，經(jīng)肝臟病理檢查證實(shí)造模成功后隨機(jī)分為3組各10只，3組實(shí)驗(yàn)過程中均給予高脂飼料喂養(yǎng)。白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組分別給予白藜蘆醇50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)灌胃，高脂組和正常組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃6周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1血脂指標(biāo) 所有小鼠干預(yù)結(jié)束后禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(45 mg/100 g)麻醉后眼眶靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定TC和TG水平。

1.5.2肝組織HE染色病理表現(xiàn) 取各組小鼠肝組織，在4%多聚甲醛中4 ℃固定12 h，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，蘇木精染色8 min，自來水洗滌60 min，伊紅室溫復(fù)染60 s，封片，顯微鏡下觀察。

1.5.3肝組織油紅染色病理表現(xiàn) 取各組小鼠肝組織冰凍切片，放入油紅染液中，酒精洗片，蘇木精染色，酒精酸化，蒸餾水沖洗，封片，顯微鏡下觀察。

1.5.4肝臟組織中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)和過氧化物酶增殖物激活受體α(PPAR-α)mRNA表達(dá)情況 使用Trizol試劑提取總RNA，采用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，95 ℃下30 s預(yù)變性，95 ℃下5 s，60 ℃下退火32 s，共40次循環(huán)。將β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化使用2-ΔΔCt方法。引物序列: β-actin正向引物為5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向引物為5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；PPAR-α正向引物為5’-GAGAATCCACGAAGCCTACCTG-3’，反向引物為5’-GACCTCTGCCTCTTTGTCTTCG-3’；SREBP-1c正向引物為5’-GAAACCCGAAGTGGTGGAGAC-3’，反向引物為5’-TGGGCTTTGACCTGGCTATC-3’。

1.5.5肝臟組織中Notch1蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：肝臟組織加入蛋白裂解液勻漿，進(jìn)行蛋白定量。上樣后應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、洗膜，加一抗4 ℃孵育過夜，加二抗孵育2 h，曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件對(duì)灰度進(jìn)行測(cè)量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血脂指標(biāo)比較 高脂組小鼠血清TG、TC水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠血清TG、TC水平均明顯低于高脂組(P均<0.05)，白藜蘆醇高劑量組均明顯低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠血脂水平比較

2.2各組小鼠肝臟病理表現(xiàn) HE染色顯示，正常組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂滴；高脂組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、腫大，有壞死現(xiàn)象，肝細(xì)胞脂滴空泡較多；白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，壞死細(xì)胞和脂肪空泡均較高脂組少。見圖1。

圖1 正常組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組小鼠肝臟油紅染色表現(xiàn) 油紅染色顯示，正常組小鼠肝臟橘紅色脂滴沉積很少，高脂組小鼠肝臟橘紅色脂滴沉積較多，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠橘紅色沉積明顯少于高脂組。見圖2。

圖2 正常組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟油紅染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組小鼠肝臟組織中SREBP-1c、PPAR-α mRNA表達(dá)情況 與正常組比較，高脂組小鼠肝臟組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，PPAR-α mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與高脂組比較，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝臟組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)，PPAR-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05)；白藜蘆醇高劑量組小鼠肝臟組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于白藜蘆醇低劑量組(P<0.05)，PPAR-α mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于白藜蘆醇低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 正常組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟組織中SREBP-1c和PPAR-α mRNA表達(dá)情況

2.5各組小鼠肝臟組織中Notch1蛋白表達(dá)情況高脂組小鼠肝臟組織中Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)，白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝臟組織中Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于高脂組(P均<0.05)，白藜蘆醇高劑量組明顯低于白藜蘆醇低劑量組(P<0.05)。見圖4。

圖4 正常組和非酒精性脂肪性肝病各組小鼠肝臟組織中Notch1表達(dá)情況

3 討 論

NAFLD是因肝臟脂肪合成和脂肪分解失衡導(dǎo)致過多脂肪酸不能被肝臟代謝所致的代謝應(yīng)激性肝損傷。多種轉(zhuǎn)錄因子包括SREBP-1c和PPARs參與NAFLD的發(fā)病，其中SREBP-1c參與脂肪合成和TG聚集，而PPAR的激活可導(dǎo)致過氧化物酶體的增殖和隨后的基因表達(dá)上調(diào)，如CPT-1、瘦素和胰島素受體，從而減少脂肪生成和減輕胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂滴空泡、肝臟橘紅色脂滴沉積均較多，血清TG、TC水平及肝臟組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量增高，肝臟組織中PPAR-α mRNA相對(duì)表達(dá)量降低；白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝臟病理改變明顯好轉(zhuǎn)，血清TG、TC水平及肝臟組織中SREBP-1c mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，肝臟組織中PPAR-α mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高。提示白藜蘆醇可抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解，有助于改善NAFLD病理改變。

Notch信號(hào)從低等生物到靈長類動(dòng)物高度保守，Notch信號(hào)通路參與NAFLD的病理過程。在肥胖和胰島素抵抗小鼠模型中，Notch基因表達(dá)增加，會(huì)促進(jìn)SREBP-1c介導(dǎo)的脂肪合成，導(dǎo)致NAFLD[7]。Ba等[8]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Notch可通過下調(diào)PPAR-γ和PPAR-α表達(dá)而抑制脂肪分解。肝臟Notch信號(hào)存在于肝細(xì)胞中，其激活與機(jī)體代謝狀態(tài)相關(guān)[9]，肥胖和NAFLD婦女存在肝細(xì)胞Notch信號(hào)失調(diào)[10]。阻斷肝細(xì)胞Notch信號(hào)可同時(shí)抑制肝葡萄糖生成TG，從而減少肝臟脂肪堆積[11]。Zhao等[12]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制 Notch 基因表達(dá)，從而下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，上調(diào)PPAR-α表達(dá)，改善大鼠的脂質(zhì)代謝。這些研究結(jié)果表明，Notch信號(hào)通路通過調(diào)控SREBP-1和PPAR-α轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響脂肪生成和脂肪分解。Xiao等[13]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過miR-139-5p / Notch1信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用；Kim等[14]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制Notch1和PTEN/Akt信號(hào)傳導(dǎo)而誘導(dǎo)Caspase依賴性細(xì)胞死亡；Zhang等[15]研究證實(shí)白藜蘆醇可以抑制Notch信號(hào)通路以減輕脊髓損傷。以上研究說明白藜蘆醇可能通過影響Notch信號(hào)通路發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組小鼠肝臟組織中Notch1蛋白表達(dá)量明顯增高，提示NAFLD小鼠存在Notch1過表達(dá)；白藜蘆醇低、高劑量組小鼠肝臟組織中Notch1蛋白表達(dá)量較高脂組明顯降低，提示白藜蘆醇可抑制NAFLD小鼠肝臟中Notch信號(hào)通路，從而下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，上調(diào)PPAR-α表達(dá)，減輕肝臟脂肪病變。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過抑制Notch信號(hào)通路，下調(diào)SREBP-1c表達(dá)抑制脂肪合成，上調(diào)PPAR-α表達(dá)促進(jìn)脂肪分解，從而減輕NAFLD病理改變；Notch信號(hào)通路可能是一種潛在的新的NAFLD治療靶點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。