楊檳鈺，王南丁，馬 振，李 哲，王李雯，張 莎，陳晉玉，全依晨

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2. 西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；4. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

統(tǒng)計(jì)資料顯示,急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)已成為致死率最高的冠心病臨床類型[1]，其發(fā)生的關(guān)鍵是動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的破裂或糜爛，誘發(fā)急性血栓形成[2]。所以干預(yù)易損斑塊的形成及破裂對(duì)于臨床防治ACS，降低死亡率至關(guān)重要。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，易損斑塊的形成、破裂與機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生關(guān)系密切，炎癥反應(yīng)的發(fā)生會(huì)加速易損斑塊的形成與破裂[3-4]。益氣活血中藥復(fù)方芪丹通脈片是治療冠心病的常用藥物，前期動(dòng)物研究證實(shí)其能縮小頸動(dòng)脈粥樣硬化小鼠不穩(wěn)定斑塊，減少動(dòng)脈內(nèi)斑塊數(shù)量，降低斑塊脂質(zhì)含量，抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡，可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,降低炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用[5-6]，但其作用機(jī)制仍有待明確。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)NLR 家族的PPR能通過將炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)的前體蛋白水解并切割成其活性形式來激活炎癥細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)是一種有效的細(xì)胞內(nèi)炎癥機(jī)制[7-8]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從炎癥角度，探討芪丹通脈片是否能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，達(dá)到抗炎、維持斑塊穩(wěn)定性的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)ApoE-/-小鼠60只，體重19～21 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。本實(shí)驗(yàn)通過陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，小鼠自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。

1.2藥物浸膏干粉的制備 芪丹通脈片浸膏干粉的具體制備工藝參見文獻(xiàn)[9]，其浸膏干粉相當(dāng)于生藥的2.86 g， 批號(hào)：2002ZL068；黃芪甲苷干粉每瓶約500 mg，純度≥98%，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：A111275；丹參酮IIA干粉每瓶約1 g，純度≥98%，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：T109795。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、不穩(wěn)定斑塊組、益氣組、活血組和復(fù)方組，每組12只。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)照組小鼠給予普通飼料飼養(yǎng)，其余4組均給予高脂飼料(普通顆粒飼料中添加1.25%的膽固醇、15%脂肪的高脂飼料)喂養(yǎng)。同時(shí)益氣組灌胃黃芪浸膏干粉溶劑(0.52 g生藥/kg)，活血組灌胃丹參浸膏干粉溶劑(1.31 g生藥/kg)，復(fù)方組灌胃芪丹通脈片浸膏干粉溶劑(2 g生藥/kg)，對(duì)照組和不穩(wěn)定斑塊組灌胃等體積生理鹽水，均1次/d。連續(xù)灌胃14 d后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈外置管術(shù)(PCCP)：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，切開頸部正中皮膚，分離右頸總動(dòng)脈，右頸總動(dòng)脈周圍置入硅膠管(內(nèi)徑為0.3 mm)，鞘管上中下三段用6-0絲線固定，復(fù)位頸總動(dòng)脈，關(guān)閉頸部切口，歸籠。術(shù)后各組繼續(xù)原來干預(yù)12周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1外周血炎性因子水平 干預(yù)結(jié)束后，小鼠麻醉后摘眼球取血，放置于1.5 mL EP管中，室溫靜置2 h，于4 ℃下2 500×g離心25 min，去除沉淀，上清液保存于-20 ℃。采用ELISA法，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清IL-1β和IL-18水平，每組重復(fù)5次。

1.4.2頸動(dòng)脈斑塊HE染色組織學(xué)觀察 小鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，剖開胸腔，左心室尖部穿刺注入PBS液，剪開右心房以灌注全身血管，5 min后換用4%多聚甲醛固定液灌注20 min。分離完整的右頸總動(dòng)脈，用OCT包埋右側(cè)頸總動(dòng)脈血管標(biāo)本于冰凍頭上，冰凍切片機(jī)切成6 μm的冰凍切片并貼附于多聚賴氨酸載玻片上，-70 ℃條件下存放，常規(guī)HE染色觀察斑塊的大小、面積及結(jié)構(gòu)。

1.4.3頸動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞(CD68)、平滑肌細(xì)胞(a-actin)表達(dá)免疫熒光染色觀察 切片放于室溫下回暖30 min，晾干其表面水分；用筆圈定組織范圍，圓形直徑5～10 mm；滴加4%多聚甲醛100 μL于圓圈內(nèi)，室溫下放置5 min，4 ℃下放置10 min；甩掉多聚甲醛，放于搖床上。使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS∶Tween=1 000∶1)洗滌3次，每次5 min；晾干薄片，滴加5%BSA 100 μL于圓圈內(nèi)，室溫下封閉40 min；甩掉BSA，滴加α-actin一抗(一抗∶5%BSA=1∶100 )，放于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜；按照相同方法洗滌3次，晾干玻片，然后滴加CD68一抗(一抗∶5%BSA=1∶100 )， 放于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜；照前法洗滌3次，晾干玻片，滴加二抗(二抗∶5%BSA=1∶200)，室溫下避光孵育1 h；再避光條件下洗滌3次，滴加DAPI防猝滅劑，蓋上蓋玻片，防止氣泡殘留。用熒光顯微鏡觀察玻片組織的熒光染色情況。

1.4.4頸動(dòng)脈斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測(cè)：Trizol法提取斑塊組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用TRIzol提取單核細(xì)胞和粥樣硬化斑塊組織中的總RNA，通過Primer Express software設(shè)計(jì)NLRP3、Caspase-1、NLRP1引物，以β-actin作為對(duì)照。擴(kuò)增條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。由Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物從Gene Bank獲得，合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)。引物序列：GAPDH正向5’-GCTAAGAAGGACCAGCCAGA-3’，反向5’-CCAGCAAACCTATCCACTCC-3’；Caspase-1正向5’-TGGAAGGTAGGCAAGACT-3’，反向5’-ATAGTGGGCATcTGGGTC-3’；NLRP3正向5’-GCTAAGAAGGACCAGCCAGA-3’，反向5’-CCAGCAAACCTATCCACTCC-3’。計(jì)算機(jī)計(jì)算出CT值，以2-△△CT分析最終數(shù)據(jù)。

1.4.5頸動(dòng)脈斑塊組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：裂解少量組織塊，勻漿機(jī)勻漿，取上清，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每泳道40 μg蛋白上樣，通過SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，依次加入GADPH(1∶1 000)一抗、兔多抗NLRP3(1∶1000)及Caspase-1(1∶800)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜，5 min/次，洗滌5～6次。用封閉液1∶50 000稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，浸泡PVDF膜于二抗孵育液中，37 ℃下?lián)u床孵育2 h。再次TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜，5 min/次，洗滌5～6次。顯色曝光后，采用BandScan 5.0分析膠片灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清IL-1β及IL-18水平比較不穩(wěn)定斑塊組血清IL-1β及IL-18水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；益氣組、活血組、復(fù)方組血清IL-1β及IL-18水平均明顯低于不穩(wěn)定斑塊組(P均<0.05)，且復(fù)方組均明顯低于益氣組、活血組(P均<0.05)，益氣組與活血組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 對(duì)照組和頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊各組小鼠血清IL-1β及IL-18水平

2.2各組小鼠頸動(dòng)脈HE染色情況 對(duì)照組小鼠頸動(dòng)脈壁光滑，無斑塊；不穩(wěn)定斑塊組小鼠頸動(dòng)脈管腔內(nèi)存在大量斑塊沉積，斑塊內(nèi)部脂質(zhì)池較大，斑塊結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定；與不穩(wěn)定斑塊組比較，益氣組、活血組、復(fù)方組小鼠斑塊內(nèi)部脂質(zhì)池縮小，斑塊的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，其中復(fù)方組病變最輕。見圖2。

圖2 對(duì)照組和頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊各組小鼠頸動(dòng)脈HE染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組小鼠頸動(dòng)脈組織中CD68、α-actin免疫熒光染色表現(xiàn) 對(duì)照組平滑肌細(xì)胞(紅色)較多，巨噬細(xì)胞(綠色)非常少；不穩(wěn)定斑塊組巨噬細(xì)胞明顯增多，平滑肌細(xì)胞顯著減少；益氣組、活血組、復(fù)方組巨噬細(xì)胞較不穩(wěn)定斑塊組明顯減少，平滑肌細(xì)胞較不穩(wěn)定斑塊組增多，且復(fù)方組與益氣組、活血組比較巨噬細(xì)胞少，平滑肌細(xì)胞多。見圖3。

圖3 對(duì)照組和頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊各組小鼠CD68、α-actin免疫熒光染色情況

2.4各組小鼠頸動(dòng)脈斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)情況 不穩(wěn)定斑塊組斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；益氣組、活血組、復(fù)方組斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于不穩(wěn)定斑塊組(P均<0.05)，且復(fù)方組均明顯低于益氣組、活血組(P均<0.05)，益氣組與活血組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 對(duì)照組和頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊各組小鼠斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)情況

2.5各組小鼠頸動(dòng)脈斑塊組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)情況 不穩(wěn)定斑塊組斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；益氣組、活血組、復(fù)方組斑塊組織中NLRP3、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于不穩(wěn)定斑塊組(P均<0.05)，且復(fù)方組均明顯低于益氣組、活血組(P均<0.05)，益氣組與活血組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 對(duì)照組和頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊各組小鼠斑塊組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

目前研究表明，易損斑塊的形成與破裂是ACS發(fā)病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[2]，而脂質(zhì)的代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、炎癥反應(yīng)的發(fā)生在易損斑塊的發(fā)生、發(fā)展過程中起著十分重要的作用。炎癥是先天免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)不利刺激作出的一種防御性反應(yīng)，機(jī)體在遭受到外源性感染或在內(nèi)源性細(xì)胞組織損傷的情況下均會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)[10-11]。組織損傷和穩(wěn)態(tài)參數(shù)的改變均能誘導(dǎo)先天性免疫細(xì)胞激活并釋放危險(xiǎn)信號(hào)，釋放出來的危險(xiǎn)信號(hào)為危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMPs)，機(jī)體的防御系統(tǒng)須通過模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別出DAMPs后才會(huì)被啟動(dòng)，然后再進(jìn)一步激活炎癥通路而引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎性小體即是其中的一種PRRs[12-13]。NLRPS炎性小體活化需要2個(gè)信號(hào)，信號(hào)1是由PRRs(如TLRS)識(shí)別刺激信號(hào)，活化核因子κB(NF-κB)途徑增加IL-1β和IL-18前體的合成[7]；信號(hào)2是刺激信號(hào)激活NLRP3炎性小體，活化Caspase-1，剪切IL-1β和IL-18 前體，釋放成熟的IL-1β和IL-18 參與炎癥反應(yīng)[14]。各種炎性因子的活化、NLRP3 炎性小體的激活可引起炎癥細(xì)胞的募集，炎癥反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[15-16]。

“冠心病”歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”的范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛多為氣虛，標(biāo)實(shí)則多為血瘀，因此益氣活血法是本病的基本治則之一[17]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了益氣中藥、活血中藥與中藥復(fù)方芪丹通脈片干預(yù)模型小鼠易損斑塊的形成與發(fā)展及對(duì)NLRP3炎癥小體的影響，結(jié)果顯示不穩(wěn)定斑塊組大量斑塊沉積且斑塊最不穩(wěn)定，吞噬細(xì)胞明顯增多，平滑肌細(xì)胞顯著減少，血清IL-1β、IL-18水平及斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高；各藥物組斑塊結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，巨噬細(xì)胞明顯減少，平滑肌細(xì)胞增多，血清IL-1β、IL-18水平及斑塊組織中NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，其中復(fù)方組改變最明顯。說明益氣活血中藥可以下調(diào)NLRP3、Caspase-1的表達(dá)，抑制NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減少不穩(wěn)定斑塊的形成，且芪丹通脈片的作用優(yōu)于單純活血或益氣中藥。

綜上所述，炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)易損斑塊的形成與破裂，而NLRP3炎癥小體激活會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)，加速易損斑塊的形成與破裂；芪丹通脈片可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，下調(diào)IL-1β、IL-18及Caspase-1表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，起到穩(wěn)定斑塊的作用。但由于機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的機(jī)制復(fù)雜多樣，中藥干預(yù)炎癥反應(yīng)發(fā)生的各種機(jī)制之間是否存在相互作用，存在怎樣的相互作用還需后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。