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        外源性透明質(zhì)酸對人牙周膜細(xì)胞增殖及成牙骨質(zhì)、成纖維分化的影響

        2022-10-15 03:43:56金潔琪光夢凱
        中日友好醫(yī)院學(xué)報 2022年4期
        關(guān)鍵詞:牙骨質(zhì)牙周膜成骨

        金潔琪,光夢凱

        (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科,北京 100050;2.中日友好醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心,北京 100029)

        透明質(zhì)酸(hyaluronan,HA)廣泛存在于人體軟組織及結(jié)締組織,包括牙周膜組織等的細(xì)胞外基質(zhì)中,其對抗炎、傷口愈合起關(guān)鍵作用,目前臨床上應(yīng)用廣泛[1,2]。內(nèi)源性HA 作為牙周膜組織的重要組成部分,可以抗炎并促血管生成及傷口愈合[3],而外源性HA 對牙周組織的應(yīng)用有待進一步研究。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)有分化潛能[4],本實驗旨在研究在HA 的作用下其增殖及分化的情況,為HA 應(yīng)用于牙周疾病的治療提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 實驗材料

        細(xì)胞為慕尼黑大學(xué)牙學(xué)院基礎(chǔ)實驗室自有hPDLCs 細(xì)胞系。成骨誘導(dǎo)(osteogenic stimulation,OS)液:FBS,盤尼西林鏈霉素,地塞米松,L-抗壞血酸,β-甘油磷酸鹽,抗壞血酸等(均來自美國Sigma 公司)加入細(xì)胞培養(yǎng)液配成。HA 來自Hyalose 公司。查文獻后選擇分子量3~6Da 的Nano HA 及分子量150K Da 的HA。實驗中HA 濃度為20ng/ml[5]。

        1.2 實驗方法

        實驗分組:空白對照組(Con);OS 組(osteogenic stimulation,+OS,陽性對照);Nano HA 組(+OS+Nano HA);150K HA組(+OS+150K HA)。

        21d 細(xì)胞培養(yǎng):hPDLCs 培養(yǎng)于37℃,5% CO2的恒溫箱中,每周換液2 次。每周同一時間對細(xì)胞進行顯微鏡拍照及形態(tài)學(xué)觀察。

        細(xì)胞增殖WST-1檢測:將hPDLCs均勻種在4盒48 孔培養(yǎng)皿中,等待48h,細(xì)胞完全附著生長后,標(biāo)記為起點,分別在第0d,7d,14d,21d 進行細(xì)胞增殖測驗。WST-1 試劑盒來自Roche 公司,加入培養(yǎng)皿30min后,將細(xì)胞進行ELISA測試。

        對牙骨質(zhì)相關(guān)的牙骨質(zhì)附著蛋白(cementum attachment protein,CAP),牙骨質(zhì)蛋白(cementum protein 1,CEMP1),韌帶相關(guān)的Scleraxis(SCX),感染相關(guān)的Toll 樣受體(toll like receptor 4,TLR4)基因進行rt-PCR 檢測:將hPDLCs 均勻種在6孔培養(yǎng)皿中,等待48h,細(xì)胞完全附著生長后,標(biāo)記為起點,分別在第0d,3d,7d,21d 刮取細(xì)胞,提取RNA,轉(zhuǎn)化為cDNA 后,進行rt-PCR 試驗。管家基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)。具體基因序列見表1。1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

        表1 rt-PCR檢測的標(biāo)記物的基因序列

        應(yīng)用Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩兩比較采用t檢驗,組間比較采用one-way ANOVA。

        2 結(jié)果

        2.1 hPDLCs21d細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

        由圖1(見封二)可見,A 組空白對照組中hPDLCs 呈梭形生長,隨著培養(yǎng)時間的增加,集落逐漸融合,細(xì)胞均勻聚集分布,培養(yǎng)后期細(xì)胞逐漸經(jīng)緯狀交疊,細(xì)胞形態(tài)尖銳,邊緣伸展(圖A1~A3)。C 組為Nano HA 組(圖C1~C3),D 組為150K HA組(圖D1~D3),細(xì)胞形態(tài)均較空白對照組較為圓鈍,邊緣收縮,細(xì)胞培養(yǎng)后期(21d)時尤為明顯。B 組為成骨誘導(dǎo)的陽性對照組OS 組(圖B1~B3),hPDLCs 形態(tài)介于空白對照組及HA 組之間,較空白對照組圓鈍,但細(xì)胞收縮程度不如HA組明顯。

        圖1 hPDLCs培養(yǎng)7d、14d、21d時顯微鏡下觀察照片(×10)

        2.2 HA抑制hPDLCs增殖

        實驗初期,各組細(xì)胞生長速度接近,組內(nèi)無統(tǒng)計學(xué)差異。從第7d 開始,空白對照組顯著高于OS 組及150K HA 組(P<0.01);OS 組顯著高于Nano HA 組(P=0.0009)。第14d 時,hPDLCs 增殖速度空白對照組>OS 組>Nano HA 組>150K HA 組。第21d 時,空白對照組增速顯著高于Nano HA 組及150K HA組(P<0.01);OS組細(xì)胞增殖速度亦顯著高于Nano HA 組及150K HA 組(P=0.0398,P=0.0057)。Nano HA 與150K HA 兩組之間細(xì)胞增殖速度無明顯差異。綜合看來HA 對hPDLCs 增殖明顯有抑制作用,見圖2。

        圖2 PDLCs WST-1增殖實驗

        2.3 HA抑制hPDLCs表達(dá)CAP

        圖3A 示,7d 時4 個組的CAP 表達(dá)均達(dá)到高峰,而21d 時回落至初始線以下。3d 時可見空白對照組比OS,Nano HA 組及150K HA 組都高(P<0.01);OS 組亦高于150K HA 組(P=0.0191),可見150K HA 對CAP 表達(dá)有抑制作用。7d 時2 個HA組CAP 表達(dá)亦低于空白對照和OS 組,Nano HA組更是低于150K HA 組(P=0.0103)。21d 時,HA組的CAP表達(dá)亦低于空白對照組,而與OS組無統(tǒng)計學(xué)差異??傊瓾A 基本上抑制hPDLCs 表達(dá)CAP。

        2.4 HA抑制hPDLCs表達(dá)CEMP1

        圖3B 示,HA 刺激下,hPDLCs 中CEMP1 的表達(dá)與CAP 類似,7d 時均有較高的表達(dá),21d 時回落。3d 時,HA 對CEMP1 的表達(dá)有抑制作用,HA組均低于空白對照組和OS 組。7d 時,空白對照組最高,而OS 組,Nano HA 組及150K HA 組內(nèi)無明顯差異。21d 時,Nano HA 組與空白對照組的CEMP1 表達(dá)無明顯差異;而空白對照組的表達(dá)高于OS組及150K HA組(P=0.0036,P=0.0004);Nano HA 組的CEMP1 表達(dá)亦高于150K HA 組(P=0.0375)??傊瓾A,尤其是150K HA抑制hPDLCs表達(dá)CEMP1。

        2.5 150K HA先促進后抑制hPDLCs表達(dá)SCX

        圖3C 示,hPDLCs 的表達(dá)量很低。前3d 各組之間SCX的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。7d時,OS組和150K HA 組的SCX 表達(dá)顯著高于空白對照組,亦顯著高于Nano HA 組(均P<0.01)。21d 時,空白對照組SCX 表達(dá)升高,而150K HA 組表達(dá)降低,顯著低于空白對照組,P=0.004)。

        圖3 hPDLCs rt-PCR 中CAP、CEMP1、SCX的表達(dá)

        2.6 HA促進hPDLCs表達(dá)TLR4

        圖4 示,前期hPDLCs 的TLR4 表達(dá)在較低水平,而在21d 時顯著提升。3d 時HA 組TLR4 表達(dá)顯著高于空白對照組及OS組;Nano HA組亦高于150K HA 組(P=0.0378)。7d 時各組表達(dá)均高于空白對照組,而150K HA 組則低于OS 及Nano HA 組(P=0.0461,P=0.0132)。21d 時各組高于空白對照組,而OS 組、Nano HA 組及150K HA 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義??傊?,HA 尤其是Nano HA,促進hPDLCs表達(dá)TLR4。

        圖4 hPDLCs rt-PCR 中TLR4的表達(dá)

        3 討論

        本實驗細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察中,在Nano HA 和150K HA 刺激下,hPDLCs 形態(tài)較空白對照組明顯圓鈍;印證了Al-Rekabi等學(xué)者的研究成果:HA可提高h(yuǎn)PDLCs 的收縮性,且降低其細(xì)胞遷移能力。該實驗中,HA 刺激下的hPDLCs 形態(tài)較對照組明顯收縮[6]。HA 對大部分細(xì)胞有抑制增殖的作用[7],在本實驗中亦得到了驗證。不過也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HA 可以促進PDL 細(xì)胞增殖[8],其觀測時間為細(xì)胞種植后的3d 和5d,與本實驗不同;且使用的HA 分子量未知,而HA 對細(xì)胞的作用與HA的分子量相關(guān),因此與本實驗結(jié)論相悖。

        牙周附著喪失是牙周炎癥的重要表現(xiàn)。CAP和CEMP1 是牙周附著及牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白[9]。hPDLCs是具有分化潛能的細(xì)胞,在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)下可以分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞[10]。可惜在本實驗中,2種HA 都對hPDLCs 的成牙骨質(zhì)分化起抑制作用。7d 時所有組CAP 及CEMP1 表達(dá)均升高而在21d回落,HA 組表達(dá)CAP 均低于空白對照組,但無統(tǒng)計學(xué)差別;21d 時150K HA 明顯抑制CEMP1 表達(dá)。SCX 是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞形成纖維組織的蛋白,可以促上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,對組織愈合纖維形成起關(guān)鍵作用[11]。此外SCX還可以機械壓力下促進腱細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖,從而修復(fù)肌腱[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)150K HA 在7d 可促進SCX 表達(dá),而在21d 時抑制hPDLCs 表達(dá)SCX??紤]到牙周組織承受各種咀嚼壓力,因此很有必要進一步研究HA 對SCX 的調(diào)節(jié)作用。TLR4 是炎癥相關(guān)因子,炎癥狀態(tài)下可激活組織免疫反應(yīng)[13]。TLR4 還可以調(diào)節(jié)hPDLCs 的成骨分化[14]。本實驗中,2 種HA,尤其是Nano HA,在3d 可明顯促進hPDLCs表達(dá)TLR4,21d 時OS 組與HA 組間無差異,但亦均明顯高于空白對照組。HA 可誘導(dǎo)受損組織中成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞分化以修復(fù)受損傷的組織[15]。此外HA 還可以誘導(dǎo)軟骨、韌帶的修復(fù)及hPDLCs 神經(jīng)方向的分化[16,17],且可以促進hPDLCs早期成骨分化[8]。有學(xué)者在老鼠牙周炎模型上使用了HA 凝膠,得到很好的骨再生[18]。因此HA在牙周炎患者的臨床應(yīng)用還是很有前景。

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