牛建增，韓 懿，郭建博

（天津城建大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，天津 300384）

苯酚是一種具有苯環(huán)的芳香族化合物，在煉油、化工、造紙等工業(yè)生產(chǎn)過程中有著重要的用途[1].因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定、腐蝕性強(qiáng)、生物降解性差、且致癌性和誘變性強(qiáng)而被列為重點(diǎn)有機(jī)污染物[2-4].人們對(duì)于含酚芳香族化合物廢水的治理越來越重視[5].水體中的可溶性芳香族化合物可以通過活性炭吸附[6]、溶劑萃取[7]、化學(xué)氧化[8]和生物處理[9]等工藝去除.吸附和溶劑萃取可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)污染物的轉(zhuǎn)移不能達(dá)到芳香族化合物的分解礦化.而化學(xué)氧化不僅成本高昂、應(yīng)用困難且通常氧化不完全而導(dǎo)致去除效率低.生物降解具有效率高、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn).所以，生物處理是最佳選擇，但高濃度芳香族化合物會(huì)對(duì)微生物具有毒害作用[10]，研究表明它仍然可以被某些微生物降解礦化.例如：產(chǎn)甲烷聚生體細(xì)菌、硫酸鹽還原細(xì)菌、反硝化細(xì)菌以及金屬還原細(xì)菌[11]，其中反硝化細(xì)菌降解礦化效果尤為突出.

通常某些化工廢水同時(shí)含有硝酸鹽和含酚芳香族化合物[12].有研究表明，在生物反硝化體系中芳香族化合物能以NO3--N為電子受體而被分解礦化[10].因此利用微生物將芳香族化合物為電子供體，硝酸鹽為電子受體的特性，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)脫氮和芳香族化合物降解.反硝化降解菌的篩選[13]以及反應(yīng)工藝對(duì)于此類廢水的去除效果探究[9]是目前研究的熱點(diǎn).但是在這個(gè)過程中，芳香族化合物會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用，可能導(dǎo)致細(xì)菌裂解，死亡，進(jìn)而導(dǎo)致反硝化系統(tǒng)惡化.因此，芳香族化合物與生物反硝化之間的相互作用是研究的熱點(diǎn).有研究表明，胞外聚合物（EPS）是細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下分泌的有機(jī)物，可以有助于建立成熟的生物膜結(jié)構(gòu)，保護(hù)微生物免受外部環(huán)境干擾，同時(shí)也能起到緩沖作用，降低廢水中大量有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的不利影響[14].Jain等[15]研究發(fā)現(xiàn)EPS可以改變細(xì)菌的表面電荷，進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)目標(biāo)污染物的去除能力.此外，Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)EPS可以促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移從而有利于污染物的去除.HE等[17]研究發(fā)現(xiàn)電子傳遞活性、細(xì)胞膜通透性、能量的產(chǎn)生是加速污染物降解的必要過程.但是關(guān)于此類廢水在UASB反應(yīng)器運(yùn)行過程中EPS含量變化對(duì)污染物降解的影響機(jī)理及從微生物代謝活性角度分析的研究報(bào)道較少.

本研究采用上流式厭氧污泥床（UASB）反應(yīng)器，選用苯酚作為典型的芳香烴化合物，逐步替換乙酸鈉，從而成功構(gòu)建了苯酚反硝化系統(tǒng).在進(jìn)水苯酚濃度為0～333 mg/L的條件下探究以下內(nèi)容：①反硝化系統(tǒng)的硝酸鹽與苯酚的去除性能，并進(jìn)一步闡明苯酚對(duì)反硝化系統(tǒng)中苯酚與硝酸鹽同步去除的影響；②EPS的變化響應(yīng)以及其對(duì)反硝化系統(tǒng)穩(wěn)定高效運(yùn)行的調(diào)控機(jī)制；③微生物代謝水平的變化響應(yīng)及其與反硝化系統(tǒng)下苯酚和氮同步代謝的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置和接種污泥

裝置采用UASB（見圖1），材質(zhì)是有機(jī)玻璃，內(nèi)徑68 mm，高710 mm，有效容積3.5 L.接種污泥來自天津某污水處理廠的二沉池.反應(yīng)器由蠕動(dòng)泵從底部進(jìn)水，進(jìn)水方式為硝酸鹽和COD各一個(gè)進(jìn)水桶，該系統(tǒng)以連續(xù)流的方式運(yùn)行119 d.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意

1.2 實(shí)驗(yàn)廢水

實(shí)驗(yàn)采用合成廢水，成分為：NaNO3，CH3COONa，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，苯酚，1.00 mL/L微量元素濃縮液.微量元素成分見表1.硝酸鹽由NaNO3提供，化學(xué)需氧量（COD）由無水乙酸鈉和苯酚提供.濃度按照實(shí)驗(yàn)需要配置，所用藥品均為分析純.

表1 微量元素主要成分

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

反應(yīng)器以初始狀態(tài)運(yùn)行時(shí)，進(jìn)水以乙酸鈉作為唯一碳源并使進(jìn)水COD保持為800 mg/L，NO3--N濃度為200 mg/L，進(jìn)而馴化污泥適應(yīng)反硝化條件.啟動(dòng)完成后，進(jìn)水中加入苯酚來改變進(jìn)水中COD，同時(shí)改變進(jìn)水碳氮比（C/N）.在階段Ⅰ—Ⅲ中考察不同C/N（4.0/1，4.3/1，4.6/1）下反硝化的性能和苯酚去除效果，階段Ⅳ—Ⅶ保持碳氮比（C/N）為4.0，增加苯酚濃度逐漸替換乙酸鈉，并檢測(cè)胞外聚合物（EPS）含量分析反應(yīng)器性能與EPS的關(guān)系.通過對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行過程中ATP含量、細(xì)胞膜通透性、ETSA的檢測(cè)，進(jìn)一步從微生物代謝活性角度進(jìn)行分析.具體運(yùn)行過程如表2所示（1 g乙酸鈉相當(dāng)0.8 gCOD，1 g苯酚相當(dāng)2.4 gCOD）.

表2 運(yùn)行過程

1.4 分析方法

硝酸鹽（NO3--N）采用紫外分光光度法測(cè)定[18].亞硝酸鹽（NO2--N）采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法[18].本實(shí)驗(yàn)采用可見比色法，用消解儀（Hach，DRB200）和分光光度計(jì)（Hach，DR3900）測(cè)定COD濃度.苯酚采用高效液相色譜儀分析[19].三磷酸腺苷（ATP）按文獻(xiàn)報(bào)道的方法提取，ATP的測(cè)定用高效液相色譜儀分析[17].細(xì)胞膜通透性測(cè)定方法是基于領(lǐng)硝基苯酚β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）的水解反應(yīng)，即ONPG法[20].電子傳遞系統(tǒng)活性（ETSA）的測(cè)定采用INT-ETSA檢測(cè)方法[21].胞外聚合物（EPS）采用熱提法提取[22].用考馬斯亮藍(lán)法和蒽酮-硫酸法測(cè)定EPS中的蛋白質(zhì)（PN）和多糖（PS）的濃度[23].混合液體懸浮物（MLSS）采用烘箱烘至恒重，混合液體懸浮物（MLVSS）采用馬弗爐灼燒質(zhì)量法測(cè)定[18].

2 結(jié)果與討論

2.1 UASB反應(yīng)器運(yùn)行性能

根據(jù)進(jìn)水苯酚濃度及進(jìn)水碳氮比（C/N），將整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為7個(gè)階段，系統(tǒng)中脫氮性能、苯酚和COD去除效果如圖2所示.

圖2 苯酚反硝化系統(tǒng)運(yùn)行過程中脫氮性能、苯酚去除效果、COD去除效果

階段I（1～29 d）：苯酚濃度為0 mg/L，乙酸鈉作為碳源濃度為1 000 mg/L（COD800 mg/L），硝酸鹽濃度200 mg/L，C/N為4.0，經(jīng)過29 d運(yùn)行，反硝化顆粒污泥成功培養(yǎng)；硝酸鹽和COD的去除率分別達(dá)到99.5%和95.13%，系統(tǒng)出水COD為38.98 mg/L.結(jié)果表明：反硝化污泥已經(jīng)馴化成熟.階段II（30～44 d）：苯酚濃度和乙酸鈉濃度分別為25 mg/L（COD60 mg/L）和1000 mg/L（COD800 mg/L）；該階段C/N為4.3，系統(tǒng)穩(wěn)定后，硝酸鹽去除率可達(dá)99.5%；COD去除率為93.78%；苯酚去除率為80.41%.階段Ⅲ（45～54 d）：苯酚為50 mg/L（COD 120 mg/L）；乙酸鈉濃度為1 000 mg/L（COD800 mg/L）；苯酚反硝化系統(tǒng)該階段C/N為4.6；穩(wěn)定后硝酸鹽去除率可達(dá)99.5%；COD去除率為89.29%；苯酚去除率為55.42%.階段Ⅳ（55～69 d）：苯酚濃度為50 mg/L（COD 120 mg/L）；減少乙酸鈉使C/N穩(wěn)定為4.0；穩(wěn)定后硝酸鹽去除率可達(dá)99.5%；COD去除率為94.61%；苯酚去除率可達(dá)99.6%.階段Ⅴ（70～84 d）和階段Ⅵ（85～99 d）：苯酚濃度分別為100 mg/L（COD240 mg/L）和200 mg/L（COD480 mg/L）；乙酸鈉濃度分別為700 mg/L（COD 560 mg/L）和400 mg/L（COD320 mg/L）；苯酚反硝化體系該時(shí)期C/N為4.0；硝氮、總氮和苯酚去除率均可達(dá)99.5%以上；COD去除率分別為94.77%和94.64%.階段Ⅶ（100～119 d）：苯酚濃度為333 mg/L（COD800 mg/L）；乙酸鈉濃度為0 mg/L；C/N為4.0；開始時(shí)反硝化受到抑制，硝氮、總氮和苯酚去除率分別為76.99%、70.80%和66.31%；但是經(jīng)過4 d適應(yīng)后硝氮、總氮和苯酚去除率分別為99.5%、99.5%和98.78%；苯酚反硝化體系運(yùn)行平穩(wěn)后三者去除率均可提升到99.5%以上，系統(tǒng)COD去除率穩(wěn)定在95.30%.結(jié)果表明：UASB反應(yīng)器中馴化的反硝化污泥在不同的C/N（4.0/1，4.3/1，4.6/1）條件下優(yōu)先利用乙酸鈉作為碳源；在UASB反應(yīng)器的HRT為4.0 h，C/N為4.0，進(jìn)水苯酚濃度（0～333 mg/L）的情況下，苯酚可以作為反硝化的碳源且被完全降解，并成功構(gòu)建苯酚反硝化系統(tǒng)且對(duì)苯酚脅迫表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受性.系統(tǒng)出水COD為37.59 mg/L（＜50 mg/L），符合《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18918—2002）一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn).

馬等[12]在SBR反應(yīng)器中經(jīng)過149 d的馴化實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖和苯酚為碳源同時(shí)脫氮的反硝化過程，而本實(shí)驗(yàn)在UASB反應(yīng)器中119 d內(nèi)即實(shí)現(xiàn)了以苯酚為唯一碳源且高效脫氮的苯酚反硝化.此外，王等[24]的研究中以苯酚為唯一碳源在C/N為4.0時(shí)苯酚去除率為83.3%，而本實(shí)驗(yàn)中C/N為4.0時(shí)苯酚去除率可達(dá)99.5%以上.Sylvia等[25]的研究中在處理進(jìn)水濃度為335 mg/L苯酚時(shí)，采用5.8的C/N和23 h的HRT，苯酚去除率達(dá)到99%.而在本研究中采用4.0的C/N和4 h的HRT，對(duì)進(jìn)水濃度為333 mg/L的苯酚去除率超過99.5%.更低的C/N和更短的HRT表明，本研究相比于其他工藝有著高效低耗的優(yōu)勢(shì).

2.2 UASB反應(yīng)器內(nèi)EPS、PN與PS變化規(guī)律分析

高濃度的苯酚會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而會(huì)影響反硝化菌的脫氮性能[26].而微生物自身分泌的EPS不僅可以通過增加細(xì)菌的穩(wěn)定性來增加負(fù)荷能力，還能作為緩沖物質(zhì)來減少體系中的苯酚對(duì)細(xì)菌的毒害作用[27].因此，系統(tǒng)不同階段中EPS的濃度是有必要進(jìn)行檢測(cè)的.如圖3所示，總EPS含量從階段Ⅰ中的105.16 mg/gVSS升至階段Ⅱ—Ⅶ中的270.00，320.84，260.40，164.29，131.69，124.88 mg/gVSS.PN含量從階段Ⅰ的23.02 mg/gVSS升至階段Ⅱ—Ⅶ中的81.40，124.18，116.46，82.49，70.46，67.31 mg/gVSS.PS含量從階段Ⅰ中的82.14 mg/gVSS升至階段Ⅱ—Ⅳ中的188.61、196.67和143.94 mg/gVSS，隨后下降至階段Ⅴ—Ⅶ中的81.80，61.23，57.57 mg/gVSS.PN/PS從階段Ⅰ中 的0.28升 至 階 段Ⅱ—Ⅶ中 的0.43，0.63，0.81，1.01，1.15，1.17.階段Ⅰ—Ⅲ總EPS含量隨著苯酚濃度的增加而大幅增加.階段Ⅳ—Ⅶ總EPS含量逐漸降低歸因?yàn)槲⑸镏饾u適應(yīng)了苯酚壓迫；且從階段Ⅳ開始控制C/N比為4.0并逐步增加苯酚占比，微生物也可能利用EPS作為碳源[28].階段Ⅳ—Ⅶ中的PS逐漸降低且階段Ⅴ—Ⅶ低于階段Ⅰ，表明可通過降低PS含量來減小苯酚對(duì)微生物的毒害作用，且可通過提高電子傳遞能力來增加微生物的代謝活性，這在Zhao等[29]的研究中得到證明.階段Ⅱ—Ⅶ中的PN較階段Ⅰ均有大幅增加，PN可以促進(jìn)微生物顆粒的形成和微生物聚集[30].此外，PN/PS在階段Ⅰ—Ⅶ不斷增加.微生物絮體的疏水性與PN/PS呈正相關(guān)，可能有助于增強(qiáng)微生物顆粒的穩(wěn)定性和聚集[31].因此，反應(yīng)器中較高的PN和PN/PS為形成穩(wěn)定的顆粒污泥提供可能，從而導(dǎo)致較好的脫氮和苯酚降解性能.綜上所述，苯酚濃度的增加會(huì)刺激EPS的分泌且PN/PS不斷增加，說明EPS含量和PN/PS的變化會(huì)對(duì)反硝化的性能產(chǎn)生影響.

圖3 UASB內(nèi)PS、PN、EPS及PN/PS的變化

2.3 微生物代謝活性分析

據(jù)報(bào)道，在微生物代謝過程中幾乎所有的酶促反應(yīng)都需要能量的支持[32].此外，三磷酸腺苷（ATP）含量、細(xì)胞膜通透性、ETSA可以作為評(píng)價(jià)微生物代謝活性的關(guān)鍵指標(biāo).因此有必要檢測(cè)反應(yīng)器中ATP含量、細(xì)胞膜通透性、ETSA的變化.如圖4a所示，ATP含量從階段Ⅰ中的2.71 mg/gVSS增加到階段Ⅱ—Ⅶ中的6.59，6.83，6.95，7.06，9.66，11.39 mg/gVSS.ATP含量的逐漸增加表明反應(yīng)器中的細(xì)菌仍具有良好的代謝活性，即使在高濃度苯酚的條件下，也能為EPS分泌、顆粒污泥的形成、苯酚的生物降解等生理過程提供更多的能量.ATP含量的增加可能是由于細(xì)胞膜通透性的升高[33]，因此利用ONPG法測(cè)量了細(xì)胞膜通透性.如圖4b所示，細(xì)胞膜通透性從階段Ⅰ中的20 μmol/L提升至階段Ⅱ—Ⅶ中的33.11，40.67，46.22，53.56，67.56，70.45 μmol/L.表明在反應(yīng)器運(yùn)行期間細(xì)胞膜通透性增加.細(xì)胞膜通透性增加可能是由于細(xì)菌中的β-半乳糖苷酶活性提高[34].在反應(yīng)器脫氮和苯酚生物降解過程中，細(xì)胞膜通透性的提高可以使細(xì)菌更容易吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)ATP的合成以提高代謝活性.因此，可通過檢測(cè)ETSA來表征微生物代謝活性.如圖4c所示，ETSA從階段Ⅰ中的4.24 μg/mg/h提升至階段Ⅱ—Ⅶ中 的5.76，8.43，9.19，11.36，13.86，14.44 μg/mg/h.ETSA增加可能是因?yàn)槊摰捅椒由锝到膺^程中細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增加，從而有利于電子穿梭體（如EPS中的氧化還原性物質(zhì)）介導(dǎo)的電子傳遞[35].因此，反應(yīng)器運(yùn)行過程中ETSA的增加，使得微生物代謝活性增加有助于脫氮和苯酚生物降解.綜上可以得到苯酚濃度的增加刺激了電子傳遞系統(tǒng)的增加，有助于電子傳遞；膜通透性的增加有利于電子穿梭體轉(zhuǎn)移；大量的ATP為苯酚反硝化過程中各種生命活動(dòng)提供能量.

圖4 系統(tǒng)運(yùn)行過程中ATP、細(xì)胞膜通透性、電子傳遞活性（ETSA）的變化

3 結(jié)論

（1）UASB反應(yīng)器中馴化的反硝化污泥在不同的C/N（4.0∶1，4.3∶1，4.6∶1）條件下優(yōu)先利用乙酸鈉作為碳源；在UASB反應(yīng)器的HRT為4.0 h，C/N為4.0，進(jìn)水苯酚濃度（0～333 mg/L）的情況下，苯酚可以作為反硝化的碳源且被完全降解并成功構(gòu)建苯酚反硝化系統(tǒng)且對(duì)苯酚脅迫表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受性.系統(tǒng)出水COD為37.59 mg/L（＜50 mg/L），符合《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18918—2002）一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn).

（2）通過不同苯酚濃度對(duì)系統(tǒng)EPS的影響分析以及EPS作用分析，可以觀察到苯酚濃度的增加會(huì)刺激UASB內(nèi)微生物分泌EPS且PN/PS不斷增加，為形成穩(wěn)定的顆粒污泥提供可能，進(jìn)而對(duì)反硝化性能產(chǎn)生影響.

（3）通過對(duì)微生物代謝活性的分析，反應(yīng)器運(yùn)行過程中ATP含量、細(xì)胞膜通透性、ETSA均不斷增加.ATP含量的逐漸增加代表著反應(yīng)器中的微生物一直具有良好的代謝活性.細(xì)胞膜通透性的增加使細(xì)菌更容易吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)ATP的合成以提高代謝活性.ETSA的增加使微生物代謝活性增加有助于脫氮和苯酚生物降解.