朱彬毓，蔡穎，李亞平，張鵬程

（中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

1 腫瘤免疫治療納米藥物研究概況

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害我國(guó)人民生命健康的重大疾病，近十幾年來發(fā)病率年均增幅高達(dá)3.9%，死亡率年均增幅達(dá)2.5%。2020年，我國(guó)新增惡性腫瘤患者456.8萬例，死亡300.2萬例，居全球首位[1]。腫瘤經(jīng)典的臨床治療手段包括手術(shù)和放療等局部療法以及化療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療等全身療法，顯著改善了腫瘤患者預(yù)后。然而，經(jīng)過上述療法治療后，腫瘤患者的5年生存率在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家仍不足70%，亟需發(fā)展新的腫瘤治療策略。

免疫療法是腫瘤治療領(lǐng)域的革命性進(jìn)展[2-3]。雖然腫瘤在發(fā)生初期會(huì)激活免疫監(jiān)視，但其最終會(huì)通過多種免疫逃逸機(jī)制逃避免疫清除。已知機(jī)制包括降低腫瘤相關(guān)抗原展示、過表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子以及招募和誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞等。基于此，腫瘤免疫治療主要通過激活、恢復(fù)和增強(qiáng)患者自身的抗腫瘤免疫反應(yīng)或者引入工程化免疫細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特異和持續(xù)的腫瘤細(xì)胞清除。目前上市的腫瘤免疫療法有免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blocade，ICB）療法和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法等，在包括肺癌、黑色素瘤和B細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤的治療中展現(xiàn)出了令人鼓舞的效果。盡管如此，上述免疫療法仍面臨諸多挑戰(zhàn)。例如，ICB療法的效果依賴于患者抗腫瘤免疫細(xì)胞的激活程度和瘤內(nèi)免疫浸潤(rùn)的程度，而腫瘤內(nèi)復(fù)雜的免疫抑制微環(huán)境則限制了ICB和CAR-T細(xì)胞療法對(duì)實(shí)體瘤的治療效果[4-7]。因此，臨床上仍需發(fā)展新的腫瘤免疫治療策略，以進(jìn)一步提高腫瘤治療效果。

納米藥物在腫瘤治療領(lǐng)域逐漸展現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。納米藥物通常指粒徑在10 ～ 1000 nm的藥物遞送系統(tǒng)，其特有的體內(nèi)過程和生物相互作用有利于增加藥物在瘤內(nèi)的蓄積，降低藥物副作用[8-9]。目前上市的抗腫瘤納米藥物包括阿霉素脂質(zhì)體、伊立替康脂質(zhì)體和紫杉醇白蛋白納米粒等[10]，其中紫杉醇白蛋白納米粒與ICB療法聯(lián)合現(xiàn)已成為轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌的一線治療方案[11-12]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)納米藥物因其尺度效應(yīng)和表面特性等與免疫細(xì)胞具有明顯的相互作用[13-14]。例如，局部注射的納米顆粒相比于游離抗原更易被組織內(nèi)和引流淋巴結(jié)內(nèi)的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）所捕獲，而到達(dá)腫瘤的納米顆粒則易被瘤內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。因此，利用納米藥物增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療效果已成為研究前沿和熱點(diǎn)。但另一方面，納米顆粒會(huì)直接導(dǎo)致藥物分布的變化，而非特異性分布會(huì)產(chǎn)生特殊的不良反應(yīng)。作為外源性物質(zhì)的納米顆粒，還易觸發(fā)免疫應(yīng)答，增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和生物黏附引起的滯留效應(yīng)，最終被機(jī)體識(shí)別和清除。例如，長(zhǎng)循環(huán)阿霉素脂質(zhì)體會(huì)增加藥物在皮膚組織的外滲和滯留，在臨床上易引起手足綜合征。長(zhǎng)循環(huán)阿霉素脂質(zhì)體在多次注射后，還會(huì)通過激活補(bǔ)體和免疫球蛋白吸附，從而引發(fā)加速的血液清除效應(yīng)，促進(jìn)藥物肝清除，影響藥物向腫瘤部位和瘤內(nèi)特定細(xì)胞的蓄積。

在異質(zhì)性腫瘤內(nèi)，實(shí)現(xiàn)納米藥物對(duì)特定細(xì)胞的靶向和特異性調(diào)控是提高抗腫瘤免疫治療效果的關(guān)鍵。納米藥物的表面理化和生物特征是決定其體內(nèi)過程和細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵參數(shù)。近年來，研究者提出用細(xì)胞膜偽裝納米顆粒，這一策略有望改善納米顆粒與免疫系統(tǒng)的相互作用。利用這一策略制備的仿生納米顆粒繼承了源細(xì)胞（如紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞和血小板等）的特定生物功能，可以整合細(xì)胞膜上各種蛋白質(zhì)和分子的優(yōu)勢(shì)，使其具有更好的生物相容性和較低的免疫原性，從而逃避免疫清除，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，還可利用膜蛋白的受配體識(shí)別機(jī)制實(shí)現(xiàn)靶向遞送，在一定程度上解決了傳統(tǒng)納米藥物在腫瘤免疫治療中所面臨的問題。此外，細(xì)胞膜獲取容易且包裹流程簡(jiǎn)單，相比于傳統(tǒng)納米藥物有較大的優(yōu)勢(shì)。Hu等[15]首次用天然紅細(xì)胞膜包裹聚合物納米粒，證實(shí)了獲得的細(xì)胞膜包裹納米藥物（cell membrane-coated nanomedicines，CMNs）借助紅細(xì)胞膜的生物相容性和抗巨噬細(xì)胞吞噬能力使其血液循環(huán)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。此后，基于細(xì)胞膜包裹的納米顆粒修飾技術(shù)迅速發(fā)展，來源于不同真核細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)菌膜和細(xì)胞器膜等被廣泛用于納米顆粒表面改性，而細(xì)胞膜融合技術(shù)、細(xì)胞膜功能化技術(shù)和基因修飾技術(shù)等也被逐步探索，豐富了生物膜的來源和功能[16-19]。同時(shí)，通過采用不同的納米核心負(fù)載不同的藥物，進(jìn)一步拓展了CMNs的多樣性和應(yīng)用范圍。近年來，CMNs也被逐步用于腫瘤免疫治療，并取得了顯著的療效。CMNs通過作用于抗腫瘤免疫循環(huán)中的1個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)以提高腫瘤免疫治療效果（見圖1），主要包括：1）增加腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）以及腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens，TAAs）和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMPs）釋放；2）促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APCs）活化；3)提高腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）增殖；4）增強(qiáng)CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞識(shí)別能力；5）增強(qiáng)CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。目前，CMNs的制備技術(shù)和在傳統(tǒng)腫瘤治療中的應(yīng)用已有較全面的綜述[17,20-22]，本文將重點(diǎn)圍繞CMNs在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，探討從CMNs設(shè)計(jì)到作用機(jī)制研究方面的最新進(jìn)展，旨在為用于腫瘤免疫治療CMNs的研究和臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

圖1 抗腫瘤免疫循環(huán)及常見的細(xì)胞膜包裹納米藥物提高腫瘤免疫治療效果的策略示意圖Figure 1 Antitumor immune cycle and previously explored CMN-based strategies for improving antitumor immunity

2 細(xì)胞膜包裹納米藥物在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

2.1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡

ICD是抗腫瘤免疫循環(huán)中的第一步。因此，提高腫瘤細(xì)胞ICD是增強(qiáng)腫瘤免疫治療效果的有效手段。傳統(tǒng)的放療、化療和分子靶向治療均能夠在一定程度上誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD，然而上述療法也會(huì)同時(shí)引發(fā)全身性免疫抑制，具有局限性。光療是一種新興的腫瘤治療手段，主要通過光敏劑將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能（光動(dòng)力療法）和熱能（光熱療法），使細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵生物大分子變性失活，造成細(xì)胞急性損傷，進(jìn)而強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD[23]。光療因其良好的時(shí)空可控性和ICD誘導(dǎo)效應(yīng)，在腫瘤治療方面展現(xiàn)出巨大潛力。利用CMNs的腫瘤靶向遞送能力，能促進(jìn)光敏劑在腫瘤部位的高效蓄積以進(jìn)一步增強(qiáng)光療的選擇性和ICD誘導(dǎo)能力。其中，利用腫瘤細(xì)胞膜與腫瘤細(xì)胞的同源親和性是提高光敏劑在腫瘤內(nèi)蓄積的有效策略。例如，Kim等[24]將光敏劑毒殺紅蛋白（killer red，KR）嵌入到腫瘤細(xì)胞膜中制備的功能化脂質(zhì)體顯著提高了KR在腫瘤中的蓄積，并在局部光照下通過產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）有效誘導(dǎo)了ICD及后續(xù)抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制了同型荷瘤小鼠的原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。Xiong等[25]進(jìn)一步通過細(xì)胞膜雜合技術(shù)，將小鼠來源的ID8卵巢癌細(xì)胞與紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）的細(xì)胞膜融合獲得ID8 & RBC混合細(xì)胞膜（ID8 & RBC membrane，IRM），利用RBC和ID8細(xì)胞膜蛋白分別抑制內(nèi)吞和增加腫瘤細(xì)胞靶向，提高了負(fù)載吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）的磁性納米顆粒（Fe3O4-ICG@IRM）在ID8腫瘤內(nèi)的蓄積，從而在局部光照后產(chǎn)生強(qiáng)烈的光熱效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ICD。與裸納米粒Fe3O4-ICG相比，F(xiàn)e3O4-ICG@IRM顯著增加了免疫炎癥因子如白介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β、IL-6等的釋放，同時(shí)在ID8卵巢癌小鼠模型中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)效果。

除了利用物理刺激在腫瘤局部促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ICD之外，針對(duì)腫瘤特有微環(huán)境引發(fā)ICD也是提高特異性抗腫瘤免疫的有效手段。例如，腫瘤部位由于血液灌流異常，形成了局部乏氧微環(huán)境。單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lmo）等厭氧細(xì)菌則傾向于定植在乏氧環(huán)境，有望用于局部誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD。然而細(xì)菌作為異源微生物，在進(jìn)入血液后會(huì)被免疫細(xì)胞迅速清除。為此，Liu等[26]用RBC膜包裹選擇性刪除毒力因子的Lmo構(gòu)建了一種新型免疫治療系統(tǒng)（Lmo@RBC）。Lmo@RBC通過上調(diào)成孔蛋白GSDMC的表達(dá)并激活ROS誘導(dǎo)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-8）活化，協(xié)同觸發(fā)腫瘤細(xì)胞焦亡。產(chǎn)生的腫瘤碎片和分泌的促炎細(xì)胞內(nèi)容物可以作為腫瘤相關(guān)抗原，有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)（見圖2）。研究中Liu等[26]將紅細(xì)胞膜與Lmo混合，采用機(jī)械擠壓法制備了Lmo@RBC。相比于裸Lmo和Lmo+RBC，Lmo@RBC降低了細(xì)菌的免疫細(xì)胞清除，顯著減弱了全身性炎癥反應(yīng)。Lmo@RBC治療后小鼠的血液指標(biāo)均正常，且無慢性毒性。同時(shí)，Lmo@RBC的長(zhǎng)血液循環(huán)優(yōu)勢(shì)使其更好地定植于腫瘤乏氧微環(huán)境。通過對(duì)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、Lmo及Lmo@RBC處理小鼠的腫瘤進(jìn)行基因組分析，發(fā)現(xiàn)Lmo@RBC處理組相比于對(duì)照組在CT26細(xì)胞中誘導(dǎo)了更多成孔蛋白GSDMC的表達(dá)，增加了細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子IL-18、IL-1β的釋放和Caspase-8活化，并有效刺激了DC熟化。Lmo@RBC在體內(nèi)促進(jìn)了強(qiáng)效而持久的抗腫瘤免疫應(yīng)答，在CT26小鼠模型上有效抑制了原位瘤和轉(zhuǎn)移灶。

圖2 Lmo@RBC促進(jìn)腫瘤細(xì)胞焦亡的機(jī)制[26]Figure 2 Mechanism of Lmo@RBC-induced pyroptosis in cancer cells

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ICD不僅能夠降低腫瘤負(fù)荷，同時(shí)還能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，引發(fā)持久的腫瘤抑制，因此是一種直接而有效的抗腫瘤免疫治療策略。然而，許多腫瘤ICD誘導(dǎo)物如化療藥物、光敏劑和微生物等缺乏腫瘤細(xì)胞特異性，易造成全身性副作用。CMNs利用天然和工程化細(xì)胞膜上的膜蛋白，有助于逃避免疫清除并增加腫瘤細(xì)胞靶向，提高抗腫瘤效果。

2.2 增加抗原遞呈細(xì)胞激活

腫瘤細(xì)胞釋放的TAAs和DAMPs通過激活A(yù)PCs刺激特異性T細(xì)胞的增殖和活化。然而，隨著腫瘤進(jìn)展，瘤內(nèi)浸潤(rùn)的大量免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等會(huì)通過清除DAMPs和降解腫瘤碎片等方式，導(dǎo)致腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)的APCs不能高效激活抗腫瘤免疫，甚至還會(huì)通過DCs依賴的T細(xì)胞活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（activation-induced cell death，AICD）等機(jī)制誘導(dǎo)免疫耐受。為了彌補(bǔ)DAMPs缺乏導(dǎo)致的APCs激活不足，Bahmani等[27]探究了Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）激動(dòng)劑補(bǔ)充策略，利用血小板與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的黏附作用，用血小板膜包裹負(fù)載TLR激動(dòng)劑resiquimod（R848）的納米顆粒（platelet membrane-coated nanoparticles，PNP-R848），延長(zhǎng)瘤內(nèi)注射R848在腫瘤部位的滯留和作用時(shí)間。PNP-R848可有效促進(jìn)DCs熟化，在MC38和4T1腫瘤模型中，均激活了強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫，在促使已有腫瘤消退的同時(shí)抑制了腫瘤復(fù)發(fā)。針對(duì)AICD導(dǎo)致的腫瘤免疫耐受，Hua等[28]構(gòu)建了基于IL-10修飾的細(xì)菌仿生膜囊（bacterial biomimetic vesicles exposing IL-10，IL10-BBVs），利用IL10-BBVs的腫瘤引流淋巴結(jié)靶向作用，通過表面IL-10與DCs上的IL-10受體結(jié)合來抑制DCs依賴的AICD，有效減少了腫瘤抗原特異性CTLs的清除，增強(qiáng)了抗腫瘤免疫。

腫瘤微環(huán)境具有顯著的免疫抑制特性，因此僅激活部分抗原遞呈通路效果可能有限。為提高APCs的抗原遞呈效率，用于非腫瘤部位的腫瘤疫苗成為當(dāng)前腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)之一。腫瘤疫苗需要同時(shí)向APCs遞送TAAs和佐劑。由于腫瘤細(xì)胞膜在表面展示大量的TAAs，因而被用于包裹載有佐劑的納米顆粒，獲得個(gè)性化腫瘤疫苗。為了獲得高效的腫瘤細(xì)胞膜，Xiong等[29]在體外用阿霉素誘導(dǎo)小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞Luc-4T1發(fā)生ICD，使其展示TAAs和鈣網(wǎng)蛋白等，隨后用該細(xì)胞膜包裹載TLR7激動(dòng)劑R837的聚乳酸-乙醇酸納米粒，并發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白能夠誘導(dǎo)納米疫苗被DCs攝取，增加R837和Luc-4T1膜抗原在DCs內(nèi)的蓄積，將DCs熟化率從26.2%提高到了59.3%，進(jìn)而激發(fā)針對(duì)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，在4T1小鼠模型中有效抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。Johnson等[30]利用類似的原理，構(gòu)建了針對(duì)白血病的腫瘤疫苗。為進(jìn)一步提高納米疫苗的DCs靶向效率，Liu等[31]在源自腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜泡（cell membrane vesicles，CMVs）上，進(jìn)一步修飾了TLR9激動(dòng)劑CpG寡核苷酸和靶向DCs上過表達(dá)受體（DC特異性細(xì)胞間黏附分子3抓取非整聯(lián)蛋白受體）的適配體，DNA修飾的CMVs高效靶向DCs并進(jìn)一步刺激其成熟，而后與CD8+T細(xì)胞結(jié)合并將其激活（見圖3A）。上述DNA修飾CMVs（CMV-CpG/Apt）可使DCs熟化率從23.7%提高到43.6%，并促進(jìn)DCs釋放IL-6、IL-12p40及TNF-α等細(xì)胞因子，進(jìn)而激活抗腫瘤免疫，有效延遲了B16OVA腫瘤的生長(zhǎng)。上述納米疫苗與ICB療法聯(lián)用，在消除大部分腫瘤的同時(shí)，還能建立腫瘤特異性的免疫記憶，防止腫瘤復(fù)發(fā)。不同于上述局部注射的納米疫苗，Han等[32]將腫瘤細(xì)胞膜和紅細(xì)胞膜融合構(gòu)建了稱作納米紅細(xì)胞膜囊（nanoerythrosome）的可靜脈注射納米疫苗，利用納米化紅細(xì)胞膜向脾臟蓄積并特異性向其中APCs遞送抗原的特性，刺激抗腫瘤免疫。運(yùn)用上述技術(shù)，通過使用模型動(dòng)物手術(shù)切除腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和自體紅細(xì)胞膜，可快速構(gòu)建個(gè)體化腫瘤疫苗，在與ICB療法聯(lián)用后能顯著抑制黑色素瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

除了自體來源的細(xì)胞外，研究者們還探索了細(xì)菌來源的生物膜作為腫瘤疫苗成分的潛力。其中，細(xì)菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由革蘭氏陰性菌釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中的囊泡（20 ～ 300 nm），因其含有細(xì)菌來源蛋白、脂質(zhì)及核酸等，能強(qiáng)烈激活先天免疫系統(tǒng)，作為候選免疫佐劑日益受到關(guān)注。Cheng等[33]通過對(duì)OMVs上的ClyA進(jìn)行修飾引入SpyTag（SpT）和SnoopTag（SnT）標(biāo)簽，構(gòu)建了一個(gè)即插即用型的多功能OMVs疫苗平臺(tái)。利用構(gòu)建的TAAs上SpyCatcher（SpC）或SnoopCatcher（SnC）分別與OMVs上述2個(gè)標(biāo)簽之間的特異的肽間偶聯(lián)反應(yīng)，多種TAAs可被特異性地展示到OMVs表面，引發(fā)特異和協(xié)同的抗腫瘤免疫反應(yīng)（見圖3B）。由于其尺寸小和細(xì)菌來源特征，OMVs在局部注射后可高效向引流淋巴結(jié)積聚，并在其中被DCs捕獲，從而刺激DCs熟化。在小鼠模型上，上述基于OMVs的疫苗可消除黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶，并抑制皮下結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。上述納米疫苗策略需已知序列的TAAs，但不同腫瘤患者的TAAs各不相同。為了構(gòu)建個(gè)體化的OMVs疫苗，Zou等[34]將OMVs與腫瘤來源的細(xì)胞膜（cell membrane originated from the tumor，mT）雜交形成新的功能囊泡（mTOMVs）。該個(gè)體化腫瘤疫苗能有效增加DCs對(duì)TAAs的攝取，在小鼠模型上經(jīng)局部注射后可在腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)有效積聚，顯著抑制4T1腫瘤肺轉(zhuǎn)移。在上述工作基礎(chǔ)上，Yue等[35]通過改造大腸埃希菌，使其在阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下，產(chǎn)生展示腫瘤抗原融合蛋白溶血素A的OMVs。這些OMVs口服后可穿過腸上皮進(jìn)入前腸膜，刺激DCs熟化，在肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤小鼠模型和皮下結(jié)腸癌小鼠模型中，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)免疫記憶。

圖3 基于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)菌外膜的細(xì)胞膜包裹納米藥物疫苗Figure 3 Cell membrane-coated anticancer nanovaccine prepared from cancer cell- and bacteria-derived membrane vesicles

2.3 活化T淋巴細(xì)胞

激活的APCs通過活化效應(yīng)細(xì)胞CTLs參與抗腫瘤免疫循環(huán)。雖然正常免疫過程中APCs可通過多種共刺激分子強(qiáng)效活化CTLs，但腫瘤患者體內(nèi)APCs可能因腫瘤進(jìn)展或者治療導(dǎo)致的系統(tǒng)性免疫抑制，而難以被腫瘤疫苗完全激活。因此，研究者探索了用納米顆粒直接刺激TAAs特異性CTLs活化的策略，而如何強(qiáng)效活化特異性CTLs是其中的關(guān)鍵。在自然免疫過程中，APCs通過表達(dá)共刺激因子和分泌細(xì)胞因子等方式，刺激能識(shí)別其展示主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex I，MHC-I）抗原復(fù)合物的特異性CTLs。由于腫瘤細(xì)胞表面天然展示供CTLs識(shí)別的MHC-I抗原復(fù)合物，Jiang等[36]通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)共刺激因子抗原分化簇80（cluster of differentiation 80，CD80）的工程化腫瘤細(xì)胞，并用其細(xì)胞膜包裹聚乳酸乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]核制備了人工的抗原遞呈納米粒（antigen-presenting nanoparticles，AP-NPs）。AP-NPs具有良好的生物相容性，能不依賴于APCs直接活化特異性T細(xì)胞，控制腫瘤的生長(zhǎng)（見圖4）。相比于未表達(dá)CD80的膜包裹納米顆粒，AP-NPs顯著提高了OT-I CD8+T細(xì)胞上CD69、CD25等分子的表達(dá)，使T細(xì)胞在4 d內(nèi)增殖了近9倍，而其他所有組的細(xì)胞計(jì)數(shù)都低于實(shí)驗(yàn)初始值。在B16OVA小鼠模型中，AP-NPs與對(duì)照組相比明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了小鼠的生存期。

圖4 人工抗原遞呈納米粒的制備及其抗腫瘤免疫的作用機(jī)制[36]Figure 4 Preparation of AP-NP and its mechanism of action in cancer immunotherapy

APCs上表達(dá)的共刺激因子除CD80外，還包括CD40等其他分子。單純過表達(dá)一種刺激分子可能難以達(dá)到理想的T細(xì)胞活化效果，而體外活化的APCs則會(huì)協(xié)同上調(diào)多種共刺激因子。受此啟發(fā)，Liu等[37]通過細(xì)胞融合技術(shù)，將DCs和4T1細(xì)胞融合，促進(jìn)MHC-I抗原復(fù)合物和免疫共刺激分子在細(xì)胞膜上的表達(dá)。利用有機(jī)金屬框架納米粒作為納米內(nèi)核獲得CMNs融合細(xì)胞膜包裹納米顆粒（nanoparticle-supported fused cytomembrane，NP@FM）可發(fā)揮類似于APCs的功能活化CTLs，在體外顯著刺激脾臟來源CD8+T細(xì)胞的活化。與單獨(dú)的DCs膜和4T1膜相比，融合的細(xì)胞膜孵育CD3+T細(xì)胞后，CD8+CTLs的比例明顯上升，并在4T1小鼠模型中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答。雖然這一策略增加了共刺激因子的種類，但APCs在活化T細(xì)胞時(shí)還會(huì)分泌IL-12等細(xì)胞因子。因此，如何進(jìn)一步整合多種共刺激信號(hào)，增加納米疫苗的CTLs活化能力是未來激活抗腫瘤免疫的重要研究方向。

2.4 增加效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的識(shí)別

活化的CTLs在進(jìn)入腫瘤后需要識(shí)別腫瘤細(xì)胞方能發(fā)揮清除腫瘤作用。然而，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過下調(diào)MHC-I分子表達(dá)等機(jī)制降低抗原展示，逃避CTLs的選擇性殺傷。因此，恢復(fù)與增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫暴露日益受到關(guān)注。腫瘤內(nèi)Ⅰ型干擾素（interferons，IFNs）不足是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MHC-I表達(dá)不足的重要原因。為了特異性提高腫瘤細(xì)胞中IFNs和MHC-I的表達(dá)，Zhai等[38]首先采用基因工程手段構(gòu)建了一個(gè)過表達(dá)程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）的CTL細(xì)胞系PD1-CTLL-2，并用其細(xì)胞膜包裹載有ORY-1001的蛋白納米粒，獲得了一種表觀遺傳納米誘導(dǎo)劑OPEN。其中，ORY-1001為組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）抑制劑，可誘導(dǎo)IFNs表達(dá)。OPEN能通過表面的PD1識(shí)別腫瘤細(xì)胞上上調(diào)的程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1） 分子，從而特異性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，釋放包載的ORY-1001，上調(diào)腫瘤細(xì)胞IFN的分泌以及下游MHC-I分子的表達(dá)（見圖5）。體內(nèi)研究顯示，OPEN顯著提高了瘤內(nèi)ORY-1001暴露量，將瘤內(nèi)IFN-β水平提高了23倍，將腫瘤細(xì)胞MHC-I表達(dá)和抗原展示提升近2倍，顯著增加了瘤內(nèi)腫瘤特異性CTLs的數(shù)量、增殖和活性。由于OPEN上的PD1還能抑制腫瘤細(xì)胞上PD-L1的反饋性上調(diào)，因此在荷三陰性乳腺癌、黑色素瘤或結(jié)直腸癌的腫瘤模型小鼠上，單獨(dú)使用OPEN即可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)動(dòng)物生存期。在治療過程中，OPEN不會(huì)引起動(dòng)物顯著的血液指標(biāo)和臟器病理變化，初步證明了納米囊泡的生物安全性。腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過增加MHC-I和TAAs的胞內(nèi)降解，甚至清除MHC-I相關(guān)基因逃避CTLs的識(shí)別，如何來克服上述機(jī)制導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸還需進(jìn)一步研究。

圖5 OPEN的制備及其在腫瘤免疫治療中的作用機(jī)制[38]Figure 5 Preparation of OPEN and its mechanism of action in cancer immunotherapy

2.5 增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力

CTLs識(shí)別腫瘤細(xì)胞后，其細(xì)胞裂解活性仍受到多種免疫檢查點(diǎn)分子和腫瘤微環(huán)境的調(diào)控。例如，ICB療法即通過阻斷PD-L1/PD1介導(dǎo)的免疫抑制提高抗腫瘤免疫效果。然而，腫瘤微環(huán)境中還存在其他抑制CTLs活性的因素，包括抑制性細(xì)胞因子、抑制性細(xì)胞以及乏氧和微酸環(huán)境等。相比于抗體阻斷療法，CMNs可作用于多個(gè)靶點(diǎn)和代謝環(huán)境，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，設(shè)計(jì)合適的CMNs克服上述抑制性因素，增加CTLs的殺傷能力是研究的熱點(diǎn)之一。例如，Hong等[39]針對(duì)實(shí)體瘤微環(huán)境內(nèi)PD-L1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制CTLs活性的問題，制備了一種T細(xì)胞衍生的納米囊泡，利用其表面的PD1和TGF-β受體分別阻斷腫瘤細(xì)胞的PD-L1和微環(huán)境中的TGF-β，從而有效緩解了CTLs耗竭。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成細(xì)胞，不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞還參與CTLs的活性調(diào)控。TAMs的活性受腫瘤細(xì)胞表面CD47和微環(huán)境中因子的調(diào)節(jié)，通常認(rèn)為可將其分為抑腫瘤的經(jīng)典活化型（M1）和促腫瘤的替代活化型（M2）兩類。為了從多個(gè)水平調(diào)控TAMs。Rao等[40]利用展示高CD47親和力信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）突變體的腫瘤細(xì)胞膜、M1細(xì)胞膜和血小板膜，構(gòu)建了混合細(xì)胞膜納米囊泡（hybrid cell membrane nanovesicles，hNVs）。由于血小板膜和SIRPα突變體的對(duì)腫瘤微環(huán)境和CD47的高親和力，hNVs可在腫瘤部位高度蓄積，并拮抗性屏蔽腫瘤細(xì)胞上的CD47，進(jìn)一步通過遞送TAMs重編程信號(hào)和干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）激動(dòng)劑，促使其向M1極化。在三陰性乳腺癌小鼠模型中，相比于單獨(dú)的M1膜包裹的納米顆?；駽D47單克隆抗體處理的對(duì)照組，hNVs顯著提高了CD80+CD206lowM1的比例，有效激活了CTLs的活性，證明CD47阻斷和M2-to-M1的復(fù)極化有效地加強(qiáng)了抗腫瘤免疫（見圖6）。藥效實(shí)驗(yàn)表明，hNVs抑制了B16F10小鼠模型腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在裝載STING激動(dòng)劑環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP）后，hNVs@cGAMP還有效抑制了4T1小鼠模型腫瘤的生長(zhǎng)。

圖6 混合細(xì)胞膜納米囊泡的制備與抗腫瘤免疫的作用機(jī)制[40]Figure 6 Preparation and mechanism of action of hNVs in cancer immunotherapy

除了TAMs，腫瘤乏氧微環(huán)境也會(huì)抑制CTLs的活性。為此，Hou等[41]首先構(gòu)建了一種甘露糖修飾和羥基氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）吸附的中空介孔普魯士藍(lán)（hollow mesoporous prussian blue，HMPB）納米體系Man-HMPB/HCQ，隨后用來自巨噬細(xì)胞和葉綠體類囊體（thylakoid，TK）的混合膜修飾在Man-HMPB/HCQ表面，以減少體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，增強(qiáng)腫瘤積聚，緩解腫瘤的乏氧微環(huán)境。該CMN可以通過甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化，并通過HMPB降解釋放鐵離子和HCQ，通過干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon-regulatory factor 5，IRF5）通路，從而誘導(dǎo)TAMs更多地極化為M1型。在腫瘤微環(huán)境模擬條件下，TK-M@Man-HMPB/HCQ能快速產(chǎn)生O2，且效率與單獨(dú)的TK膜或混合膜包載的納米顆粒相似。在體外，TK-M@Man-HMPB/HCQ可以使RAW264.7細(xì)胞向M1極化，使其CD86的表達(dá)量提高近17倍。在4T1小鼠模型中，TK-M@Man-HMPB/HCQ被證實(shí)可提高M(jìn)1比例，有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。不同于Hou等[41]緩解腫瘤微環(huán)境乏氧的策略，Zou等[42]利用RBC細(xì)胞膜包裹載氧的全氟己烷和葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOX），在直接將氧氣遞送到腫瘤微環(huán)境的同時(shí)，利用GOX消耗葡萄糖生成過氧化氫，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子，重編程TAMs，有效解除了CTLs的抑制。

腫瘤細(xì)胞的無氧酵解代謝會(huì)使腫瘤的微環(huán)境處于一種“弱酸”的狀態(tài)，這種酸性微環(huán)境不僅有利于腫瘤細(xì)胞的存活，還會(huì)抑制處于其中的CTLs的活性。因此，逆轉(zhuǎn)腫瘤酸性微環(huán)境成為增強(qiáng)腫瘤免疫治療效果的一種潛在策略?；诖?，Gao等[43]用RBC膜包裹載有乳酸氧化酶（lactate oxidase，LOX）和糖酵解抑制劑（3PO）的中空二氧化錳（Hollow MnO2，HMnO2）催化納米系統(tǒng)（PMLR），獲得的PMLR用于細(xì)胞內(nèi)/外乳酸耗竭以及協(xié)同代謝治療和腫瘤免疫治療。PMLR在胞外通過LOX催化氧化反應(yīng)消耗腫瘤微環(huán)境中的乳酸，在進(jìn)入胞內(nèi)后則釋放3PO，阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解，切斷乳酸的來源，從而改變腫瘤微酸環(huán)境，提高瘤內(nèi)CTLs的活性，改善腫瘤免疫治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過消耗乳酸，該CMNs提升了M1/M2比和腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞密度，從而有效抑制了B16F10腫瘤生長(zhǎng)。

2.6 聯(lián)合免疫治療

為了進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤免疫治療的療效，研究者構(gòu)建了多功能CMNs同時(shí)增強(qiáng)抗腫瘤免疫的多個(gè)環(huán)節(jié)，以達(dá)到聯(lián)合治療的目的。上文提到，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD不僅能降低腫瘤負(fù)荷，同時(shí)還能啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，將ICD誘導(dǎo)劑整合到CMNs中是基于CMNs的聯(lián)合免疫治療的常用策略。由于ICD誘導(dǎo)劑在瘤內(nèi)發(fā)揮作用，因此許多研究探索了協(xié)同誘導(dǎo)ICD和克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的策略。Yang等[44]用RBC膜包裹熱敏型一氧化氮（nitric oxide，NO）供體-亞硝基硫醇（S-nitrosothiols，SNO）-懸垂共聚物納米粒[poly(acrylamide-coacrylonitrile-co-vinylimidazole)-SNO copolymer，PAAV-SNO]，用于NIRⅡ光敏劑IR1061和吲哚胺2，3-雙加 氧酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO-1）抑制劑1-甲基-色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）的共遞送。制備的納米顆粒（RBCm/PAAVSNO/IR1061+1-MT）在到達(dá)腫瘤后，經(jīng)局部激光照射可觸發(fā)光熱治療，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD，使高遷移率族蛋白（high-mobility group box 1，HMGB1）釋放增加了17.4%。而后RBCm/PAAV-SNO/IR1061+1-MT進(jìn)一步釋放1-MT并在原位生成NO，分別抑制腫瘤微環(huán)境中IDO-1活性和緩解腫瘤乏氧，使瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的比例增加了2.3倍，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的比例下降，對(duì)原發(fā)乳腺癌及其肺轉(zhuǎn)移灶均有良好的治療效果。同樣，Hu等[45]利用基于M1巨噬細(xì)胞膜的CMNs遞送光敏劑Ce6和IDO抑制劑1-MT，通過協(xié)同誘導(dǎo)ICD和克服免疫抑制微環(huán)境改善了腫瘤免疫治療效果。

在上述研究中，細(xì)胞膜修飾主要用于促進(jìn)CMNs在瘤內(nèi)的蓄積。有研究者進(jìn)一步運(yùn)用功能化細(xì)胞膜，來實(shí)現(xiàn)特定的免疫調(diào)控功能。例如，Liu等[46]在NP@FM的納米核心中引入了光敏劑獲得了具有光動(dòng)力治療效果的新CMNs。研究者用4T1和DC的融合膜包裹含有光敏劑（Zr6簇）的金屬有機(jī)框架納米粒PCN-224獲得了PCN@FM。該CMNs可在光照條件下產(chǎn)生ROS，使DCs的熟化率從對(duì)照組的30%增加到61%。此外，該CMNs還能利用DCs膜的T細(xì)胞刺激能力，提升瘤內(nèi)CD3+和CD8+T細(xì)胞密度，進(jìn)一步活化CTLs并增強(qiáng)免疫應(yīng)答，抑制納米光敏劑誘導(dǎo)的光動(dòng)力治療后原發(fā)腫瘤的反彈。Chen等[47]報(bào)道了一種用原發(fā)腫瘤內(nèi)TAMs細(xì)胞膜修飾上轉(zhuǎn)化納米粒得到的CMN（NPR@TAMM）。NPR@TAMM內(nèi)的上轉(zhuǎn)化納米粒在局部光照后可啟動(dòng)光動(dòng)力治療，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ICD，啟動(dòng)后續(xù)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，同時(shí)由于瘤內(nèi)的TAMs在其細(xì)胞膜上高表達(dá)克隆刺激因子1（colony stimulating factor 1，CSF1）受體，NPR@TAMM可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合由腫瘤細(xì)胞分泌的CSF1，使得TAMs分化為M2型的比例減少，最終瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的比例從（7.5±3.1）%提高到（22.6±8.5）%，而CD4+T細(xì)胞從（8.8±2.3）%提高到（29.8±8.2）%，顯著抑制了荷4T1瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)（見圖7）。

圖7 NPR@TAMM的制備及其在腫瘤免疫治療中的作用機(jī)制[47]Figure 7 Preparation and mechanism of action of NPR@TAMM in cancer immunotherapy

利用ICD誘導(dǎo)劑的療法通常適用于術(shù)前或手術(shù)難以切除的腫瘤。在切除腫瘤后，活化TAAs特異性CTLs，恢復(fù)耗竭CTLs的活性是關(guān)鍵。為此，Liu等[48]采用基因工程技術(shù)，使DC2.4細(xì)胞過表達(dá)TAAs和膜結(jié)合型抗PD1抗體，并進(jìn)一步誘導(dǎo)其成熟從而上調(diào)B7-1/2共刺激因子，獲得了一種整合了抗原自我呈遞和免疫抑制逆轉(zhuǎn)的納米疫苗（antigen self-presentation and immunosuppression reversal，ASPIRE），用于個(gè)性化的腫瘤免疫治療。ASPIRE因其納米級(jí)的尺寸、良好的穩(wěn)定性和表面黏附分子介導(dǎo)的歸巢效應(yīng)，在皮下注射后能迅速富集到腫瘤引流淋巴結(jié)中，可直接將TAAs呈遞給特異性CTLs，從而活化上述細(xì)胞。此外，ASPIRE還通過CD28/B7共刺激信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了αPD1的免疫檢查點(diǎn)阻斷效果，從而活化耗竭的CTLs，產(chǎn)生更持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)（見圖8）。在荷B16F10小鼠模型中，給予ASPIRE后，腫瘤浸潤(rùn)抗原特異性CD8+T細(xì)胞中PD-1+CD38hi細(xì)胞的頻率顯著升高，且80%左右的浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞為活性T細(xì)胞，從而顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。

圖8 ASPIRE的制備及其在腫瘤免疫治療中的作用機(jī)制[48]Figure 8 Preparation of ASPIRE and its mechanism of action in cancer immunotherapy

3 結(jié)語與展望

腫瘤免疫治療通過激活、恢復(fù)和增強(qiáng)患者的抗腫瘤免疫發(fā)揮長(zhǎng)效抗腫瘤效果，是腫瘤治療領(lǐng)域的革命性進(jìn)展。然而，由于不同患者間和腫瘤內(nèi)廣泛存在的免疫異質(zhì)性，以及現(xiàn)有療法僅作用于抗腫瘤免疫循環(huán)中的一個(gè)或部分環(huán)節(jié)，導(dǎo)致目前腫瘤免疫治療藥物響應(yīng)率低，在大部分腫瘤中效果也不甚理想?；诩?xì)胞膜修飾技術(shù)的CMNs在腫瘤免疫治療研究中已展現(xiàn)出巨大的潛力，可通過不同的工程化設(shè)計(jì)提高抗腫瘤免疫的多個(gè)環(huán)節(jié)的效率（見表1）。更重要的是，豐富的細(xì)胞膜來源、細(xì)胞膜融合技術(shù)、基因工程技術(shù)和模塊化制備技術(shù)等極大地拓展了CMNs的多樣性，有望實(shí)現(xiàn)個(gè)體化腫瘤免疫治療。同時(shí)，CMNs的臨床轉(zhuǎn)化也存在一些挑戰(zhàn)。首先，目前報(bào)道的CMNs主要用于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ICD和APCs熟化，以及提高CTLs的活性等環(huán)節(jié)，調(diào)控其他抗腫瘤免疫環(huán)節(jié)的研究仍然不多。其次，盡管最近在多個(gè)環(huán)節(jié)聯(lián)合治療中取得了一定的進(jìn)展，但如何選擇最佳干預(yù)組合，實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療效應(yīng)仍需進(jìn)一步闡明。此外，CMNs與CAR-T等細(xì)胞療法聯(lián)用的潛力尚未被探索。鑒于CAR-T技術(shù)在血液腫瘤治療中的巨大成功，采用CMNs解決其在實(shí)體瘤治療中所面臨的挑戰(zhàn)，有望突破實(shí)體瘤免疫治療的瓶頸。最后，CMNs的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)和設(shè)備尚不成熟。除了紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌等，其他種類細(xì)胞的規(guī)?；@取、培養(yǎng)以及質(zhì)量控制不易。在細(xì)胞膜提取過程中，如何分離特定的生物膜并在保留功能性膜蛋白的同時(shí)，有效去除細(xì)胞內(nèi)容物等，從而最大程度保留所需生物功能并減少潛在炎癥反應(yīng)是臨床轉(zhuǎn)化亟待解決的關(guān)鍵問題。此外，如何在工業(yè)水平上實(shí)現(xiàn)高效和完全的細(xì)胞膜包裹，以及相關(guān)設(shè)備的開發(fā)和質(zhì)量控制技術(shù)的建立，也是CMNs規(guī)模化生產(chǎn)需解決的難題之一。如何設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔有效的CMNs，如何實(shí)現(xiàn)多功能CMNs的質(zhì)量控制和批間質(zhì)量一致性仍存在巨大的挑戰(zhàn)。盡管CMNs的臨床轉(zhuǎn)化還具有上述諸多困難，但不可否認(rèn)CMNs在腫瘤免疫治療中有著巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力。

表1 細(xì)胞膜包裹納米藥物用于腫瘤免疫治療的策略Table 1 Strategies of cancer immunotherapy with CMNs

續(xù)表1