李成龍 ，陳小燕，孫遜*

（1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院 靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610061；2.德陽市人民醫(yī)院藥劑科，四川 德陽 618000）

1 自身免疫性疾病概況

自身免疫性疾病（autoimmune diseases，ADs）是一類復(fù)雜的具有器官特異性或全身性的炎癥性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）等，這類疾病通常是慢性的、難治愈的，并可能危及生命，因此嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。ADs的顯著特征是免疫系統(tǒng)自身耐受紊亂與自我攻擊加強(qiáng)，即機(jī)體免疫系統(tǒng)無法正確區(qū)分“自我”與“非我”[2]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，29種ADs的全球總發(fā)病率為7.6% ～ 9.4%[3]。目前，臨床上尚無治愈ADs的方法，藥物治療以降低疾病活動(dòng)度、改善患者生活質(zhì)量為目標(biāo)。傳統(tǒng)的廣譜、非疾病特異性的抗炎或免疫抑制類藥物的疾病響應(yīng)性低、不良反應(yīng)多，即使是近10年涌現(xiàn)出來的非抗原特異性的、作用于細(xì)胞因子或免疫細(xì)胞信號通路的生物或小分子靶向分子，其緩解自身免疫反應(yīng)的機(jī)制也是以削弱機(jī)體對抗感染和腫瘤的免疫力為代價(jià)，通常伴隨危及生命的嚴(yán)重并發(fā)癥[4]，并無法真正糾正免疫紊亂。因此，以 ADs的病理機(jī)制為著力點(diǎn)，開發(fā)高效低毒的治療新策略已成為迫切需求。

2 誘導(dǎo)免疫耐受新策略

抗原特異性免疫耐受，是指機(jī)體免疫系統(tǒng)對具有免疫原性的靶抗原表現(xiàn)出應(yīng)答缺失或不應(yīng)答的現(xiàn)象。并且，對特定抗原產(chǎn)生耐受的機(jī)體，在中止抗原刺激后，其仍能維持對該抗原的免疫耐受，但免疫系統(tǒng)對其他抗原仍具有正常的免疫應(yīng)答能力。誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受以阻斷免疫系統(tǒng)對自身或同種抗原的異常免疫響應(yīng)，同時(shí)保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的完整性，為ADs治療的終極目標(biāo)。為此，過去數(shù)十年間，研究者一直在探索能特異性抑制組織或器官自身免疫反應(yīng)的高效低毒策略。盡管進(jìn)展緩慢，但新思路的出現(xiàn)仍然令人興奮，比如基于納米技術(shù)的免疫調(diào)節(jié)性納米制劑有助于誘導(dǎo)高效的抗原特異性免疫耐受發(fā)生[5-6]，這也為從根本上為治愈ADs帶來了曙光[7]。

適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心環(huán)節(jié)是抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）攝取、加工、處理并將抗原信號提呈給T細(xì)胞，而APC具有捕獲病毒樣顆粒（納米級）的固有能力[8]，這些粒子將被過濾并富集于外周免疫器官中，包括淋巴結(jié)、脾以及肝等[9]。研究表明，粒徑在0.05 ～ 1 μm的各種合成粒子很容易被APC吞噬，且體內(nèi)生物分布在很大程度上依賴于粒子尺寸與給藥途徑[10]。比如，經(jīng)皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)和黏膜給藥的納米粒（nanoparticles，NPs）易與淋巴系統(tǒng)發(fā)生相互作用，粒徑較?。?0 ～100 nm）的粒子通常經(jīng)毛細(xì)淋巴管遷移至淋巴結(jié)[11]；較大的粒子（500 ～ 2000 nm）需借助皮下等部位的APC將其搬運(yùn)到淋巴結(jié)中[12]；而小于10 nm的粒子則在到達(dá)淋巴結(jié)后逃逸，不易蓄積[11]。經(jīng)靜脈注射的NPs則更傾向于聚集在脾、骨髓、肝、肺等器官，小于100 nm的粒子能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）的清除[13]；而粒徑在5.5 nm以下的粒子則被腎臟過濾后經(jīng)尿液排出[14]。此外，粒子尺寸還能影響與其發(fā)生相互作用的APC類型，一般認(rèn)為DC優(yōu)先攝取粒徑較小的粒子，而巨噬細(xì)胞則傾向于吞噬較大的顆粒[13]。另外，與表面帶負(fù)電的粒子相比，荷正電的NPs更容易被APC攝取，但可能具有較高的細(xì)胞毒性[15]；棒狀的金NPs在細(xì)胞中的攝取效率要高于球形與立方形粒子[16]。T細(xì)胞接受APC提呈的抗原信號后，其表型則決定了免疫反應(yīng)的類型——免疫活化或免疫耐受。因此，基于納米技術(shù)的免疫療法旨在通過影響共刺激分子的表達(dá)水平以及抗原信號的傳遞方式誘導(dǎo)產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），恢復(fù)Treg對正向免疫應(yīng)答的優(yōu)勢，從而重塑免疫穩(wěn)態(tài)并遏制ADs炎癥（見圖1）。

圖1 免疫調(diào)節(jié)性納米制劑的設(shè)計(jì)及其誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制Figure 1 Design strategies and tolerogenic mechanisms of immunomodulatory nano-preparation

3 免疫調(diào)節(jié)納米制劑用于誘導(dǎo)免疫耐受

通常，將包載耐受性抗原或共載耐受性抗原與免疫調(diào)節(jié)劑的納米給藥系統(tǒng)稱為免疫調(diào)節(jié)性納米制劑或“致耐受性”納米粒（tolerogenic nanoparticles，tNPs）。用于構(gòu)建載體的材料需同時(shí)滿足生物相容性良好、無毒、易于制備等特點(diǎn)，包括用有機(jī)材料制備的脂質(zhì)體[17]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）與聚乳酸等聚合物NPs[18]，以及以金[19]、硅[20]等無機(jī)材料所設(shè)計(jì)的載體，同時(shí)還有基于仿生納米技術(shù)的遞送策略。根據(jù)不同的分類依據(jù)，可將tNPs分為多種類型。依據(jù)免疫耐受發(fā)生的機(jī)制可以分為[8]：1）單載自身抗原的tNPs借助于免疫系統(tǒng)的天然響應(yīng)過程誘導(dǎo)耐受；2）單載自身抗原的tNPs通過作用于APC表面的共抑制信號受體發(fā)揮作用；3）tNPs共載自身抗原與免疫調(diào)節(jié)劑，免疫調(diào)節(jié)劑通過影響特定的信號通路促進(jìn)免疫系統(tǒng)針對特定抗原產(chǎn)生免疫耐受。按照靶細(xì)胞的不同，可以分為：1）靶向并誘導(dǎo)免疫原性的APC轉(zhuǎn)變?yōu)槟褪苄缘腁PC（tolerogenic antigen-presenting cell，tAPC），伴隨Treg細(xì)胞增加；2）直接靶向并誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg[21]；3）通過靶向并作用于B細(xì)胞而發(fā)揮作用。而根據(jù)不同的給藥途徑，誘導(dǎo)免疫耐受的方式有口服、鼻腔黏膜、皮膚、靜脈、淋巴結(jié)以及肌肉途徑等[1]。本綜述以不同的給藥途徑為依據(jù)，分類介紹各類tNPs的研究現(xiàn)狀。

3.1 口服途徑誘導(dǎo)免疫耐受

口服耐受對于維持機(jī)體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，有助于平衡飲食中的外源性抗原、微生物以及自身抗原所引起的免疫反應(yīng)。報(bào)道稱，人類小腸黏膜的面積高達(dá)300 m2，每平方米約含1×1012個(gè)淋巴細(xì)胞[22]。M細(xì)胞是黏膜免疫系統(tǒng)中與上皮細(xì)胞緊密相間的一種特殊的扁平細(xì)胞，專職抗原轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠?qū)⒛c腔中的抗原攝取并運(yùn)輸至腸系淋巴組織中，交由其他免疫細(xì)胞處理[23]?？诜乖?，腸絨毛上皮間的M細(xì)胞識別并攝取抗原，然后遷移至腸道相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissues，GALTs）—— 派爾集合淋巴結(jié)（peyer’s patche，PP）、孤立淋巴濾泡（isolated lymphoid follicle，ILF）以及腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，mLN）等，隨后誘導(dǎo)產(chǎn)生高表達(dá)歸巢分子C-C趨化因子受體9（C-C chemokine receptor 9，CCR9）與α4β7整合素 的Treg，并遷移至固有層引起免疫耐受?？诜坞x形式的抗原易被胃腸道的酸堿破壞，且GALTs中的低抗原濃度難以引起有效的免疫應(yīng)答，耐受效果不佳。采用納米載體對抗原進(jìn)行包載后遞送，不僅能保護(hù)抗原免遭胃腸酸堿環(huán)境降解破壞，還可以提高抗原靶向遞送至GALTs中的效率。天然或合成的高分子聚合物是構(gòu)建這類載體的常用納米料材，包括殼聚糖以及PLGA等。

表達(dá)凝血因子8（coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ）的DNA（FⅧ-DNA）是一種帶負(fù)電的生物大分子，殼聚糖是陽離子聚合物，二者可以通過靜電相互作用自組裝生成NPs，能有效防止FⅧ-DNA口服后被胃腸液消化。Dharwar等[24]利用該原理經(jīng)簡單的制備過程合成了殼聚糖-FⅧ-DNA NPs，0.02%的殼聚糖可制備成含DNA為300 mg · L-1的NPs溶液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，多次經(jīng)口給藥顯著抑制了小鼠體內(nèi)FⅧ特異性抗體的產(chǎn)生，可以在體內(nèi)持續(xù)檢測到有活性的FⅧ蛋白。同樣，Goldmann等[25]將能編碼卵清蛋白的DNA質(zhì)粒（ovalbumin-encoding plasmid-DNA，OVA/pcDNA3）硫酸鈉溶液與殼聚糖醋酸溶液在55 ℃按照1：1的體積比例混合，強(qiáng)力攪拌30 s后，成功制備出了能編碼OVA蛋白的殼聚糖-DNA NPs。多次經(jīng)口給藥后，該策略顯著抑制了BALB/c小鼠體內(nèi)OVA蛋白特異性抗體的產(chǎn)生以及過敏反應(yīng)的發(fā)生，體外脾細(xì)胞增殖率也顯著降低。細(xì)胞因子結(jié)果表明，殼聚糖-DNA NPs能有效促使1型輔助T細(xì)胞（T-helper 1，Th1）反應(yīng)向Th2與Th3型轉(zhuǎn)化。

PLGA是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)使用的一種生物可降解大分子聚合物。以PLGA為材料制備的NPs對疏水小分子、親水多肽與蛋白等大分子均具有較強(qiáng)的包載能力，且具有緩釋作用，被廣泛應(yīng)用于各類藥物遞送的研究[26]。Kim等[27]采用PLGA NPs包載二型膠原（typeⅡcollagen，CⅡ），1次經(jīng)口給藥，就能顯著降低膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collageninduced arthritis，CIA）小鼠模型的發(fā)病率與嚴(yán)重程度。免疫指標(biāo)顯示，接受治療的小鼠血清中的CII特異性IgG顯著減少，且淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）相 關(guān) 信 使RNA（messenger RNA，mRNA）表達(dá)增加，而腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNFα）相關(guān)mRNA則表達(dá)減少。Lee等[28]用PLGA NP包載交聯(lián)PEG的CⅡ表位肽CⅡ256-270（NP/PEG-pep），于第0天采用球頭灌胃針胃內(nèi)給予DBA/1小鼠。結(jié)果顯示，與模型組或空白NPs組相比，NP/PEG-pep免疫的小鼠（PP）中，白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）陽性CD4+T（IL-4+CD4+T）與IL-10+CD4+T細(xì)胞的比例顯著增加，與經(jīng)6次CII全蛋白免疫的小鼠相當(dāng)，并伴隨產(chǎn)生了對RA的遏制作用。

口服tNPs以誘導(dǎo)免疫耐受的特點(diǎn)是安全、患者順應(yīng)性好，但目前仍以臨床前研究為主，相關(guān)的臨床試驗(yàn)很少。

3.2 鼻腔黏膜途徑誘導(dǎo)免疫耐受

鼻咽部淋巴組織是指由扁桃體、淋巴結(jié)和淋巴濾泡互相通連構(gòu)成的淋巴環(huán)，又被稱為瓦爾代爾（Waldeyer）淋巴環(huán)，是鼻咽道黏膜免疫發(fā)生的主要場所。在嚙齒類動(dòng)物中，鼻咽相關(guān)淋巴組織（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）[29]的生理功能與人類Waldeyer環(huán)相似[30]。與胃腸道中的M細(xì)胞功能相似，經(jīng)鼻黏膜免疫后，抗原顆粒可能經(jīng)由M細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)給樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）與巨噬細(xì)胞以進(jìn)行處理和呈遞，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生正向黏膜免疫應(yīng)答或免疫耐受[30]。研究人員通常以PLGA、納米乳（nanoemulsions，NEs）等為載體構(gòu)建經(jīng)鼻腔黏膜途徑誘導(dǎo)免疫耐受的tNPs。

Keijzer等[31]發(fā)現(xiàn)PLGA NPs經(jīng)鼻黏膜給藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，其NALT和頸部淋巴結(jié)中Foxp3的表達(dá)顯著增加。藥效實(shí)驗(yàn)中，包載OVA的PLGA NPs能有效抑制OVA特異性的由Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；載有熱休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）表位肽的PLGA NPs經(jīng)鼻免疫后，關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥得到了有效緩解。

NEs具有粒徑可調(diào)、比表面積大、抗原包封率高等特點(diǎn)，因此，NEs常被用于遞送自身抗原以對抗ADs[32]。Wang等[33]開發(fā)了一種基于大豆油的新型NEs，并探索了其作為遞送載體經(jīng)鼻腔給藥誘導(dǎo)免疫耐受的潛力。在實(shí)驗(yàn)性小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型上，與對照組相比，包載小鼠甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，mTg）的NEs（mTg+NEs）能有效富集于鼻腔和胸腺中，且該組的甲狀腺炎癥明顯較輕。機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明，mTg+NEs顯著降低了mTg抗體與IFN-γ的水平，而顯示免疫耐受程度的IL-10、TGF-β以及Treg水平則明顯升高，表明該策略成功誘導(dǎo)模型小鼠產(chǎn)生了免疫耐受。

經(jīng)鼻腔黏膜途徑免疫，具有抗原用量小，能引起黏膜以及系統(tǒng)性免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)[34]，且還有利于藥物的腦內(nèi)遞送以對抗MS等疾病。

3.3 皮下給藥誘導(dǎo)免疫耐受

生理學(xué)上，皮膚由表皮、真皮以及皮下組織3部分構(gòu)成，其中，表皮中含有專職APC——郞格罕細(xì)胞（Langerhans, cell，LC）。一方面，LC能有效防御皮膚接觸的外源病原微生物與危險(xiǎn)信號，誘導(dǎo)正向免疫應(yīng)答；另一方面，LC可誘導(dǎo)免疫耐受，維持免疫穩(wěn)態(tài)。tNPs經(jīng)皮下注射后，一般通過兩種途徑到達(dá)淋巴結(jié)并引起免疫耐受：tNPs經(jīng)組織間液進(jìn)入淋巴管，經(jīng)淋巴回流至淋巴結(jié)；tNPs在注射部位被外周組織中的LC、巨噬細(xì)胞等攝取，隨后歸巢返回淋巴結(jié)。用于這一策略的常見納米載體有PLGA、脂質(zhì)體以及基于無機(jī)材料（氧化鐵）的表面修飾等。

機(jī)體內(nèi)，抑炎細(xì)胞因子能夠拮抗由炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的促炎反應(yīng)，二者共同維持著機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。采用納米技術(shù)共遞送抑炎細(xì)胞因子與ADs自身抗原肽，理論上可以加強(qiáng)免疫耐受發(fā)生的速度與程度。Cappellano等[35]將重組IL-10蛋白與髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白表位肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35-55）共同裝載于PLGA NPs中，經(jīng)2次皮下給藥來治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠。結(jié)果顯示，PLGA共載藥治療組小鼠的EAE疾病狀況顯著輕于單載治療組，在預(yù)防性與治療性藥效中均顯示出了強(qiáng)效的抑炎能力。說明IL-10的加入增強(qiáng)了MOG35-55誘導(dǎo)免疫耐受的能力，聯(lián)用產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。

Cho等[36]合成了兩種不同尺寸的PLGA粒子，其中800 nm的NPs用于包載MOG35-55，同時(shí)制備了包載維生素D3（vitamin D3，VD3）、TGF-β1與GM-CSF的粒徑約55 nm的粒子。研究中，攜帶抗原的NPs被DC攝?。欢?5 nm的載藥粒子則在細(xì)胞外釋放VD3、TGF-β1以及GM-CSF以維持局部的耐受性微環(huán)境，其中VD3與GM-CSF能夠誘導(dǎo)DC分化成未成熟的狀態(tài)，且持續(xù)微量的GM-CSF刺激能維持DC的未成熟狀態(tài)。藥效實(shí)驗(yàn)中，皮下注射后，雙重微粒遞藥系統(tǒng)有效下調(diào)了EAE相關(guān)引流淋巴結(jié)中的CD86+MHCⅡ+DC水平，最終通過誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受而遏制了EAE模型炎癥的發(fā)展。然而，這類策略所涉及的遞送系統(tǒng)制備過程繁瑣，并且可能存在較強(qiáng)免疫原性。

除了抗原聯(lián)合抑炎性細(xì)胞因子外，還可以采用NPs同時(shí)包載并遞送抗原與小分子免疫調(diào)節(jié)分子。1α，25-二羥VD3（骨化三醇）是VD3的活性形式，能顯著上調(diào)CD4+T細(xì)胞表面抗炎分子CD39、CD73的水平，并能增強(qiáng)TGF-β的活性[37]。昆士蘭大學(xué)的Galea等[38]構(gòu)建了共載蛋白聚糖表位肽（Aggrecan89-103）與骨化三醇的脂質(zhì)體，皮下注射用于治療蛋白聚糖誘導(dǎo)的RA小鼠。結(jié)果顯示，該方法通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖與功能、誘導(dǎo)抗原特異性Treg的產(chǎn)生，顯著降低了RA小鼠的發(fā)病率與嚴(yán)重程度。

Clemente-Casares等[39]將結(jié)合多肽的主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ分子共價(jià)連接在葡聚糖或聚乙二醇化的氧化鐵NPs表面（peptides bound to major histocompatibility complex classⅡ，pMHCⅡ-NPs），皮下注射給予不同的ADs小鼠模型。結(jié)果顯示，pMHCⅡ-NPs能在不損害免疫系統(tǒng)情況下，有效觸發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗原特異性調(diào)節(jié)性1型CD4+T細(xì)胞（antigen-specific regulatory CD4+T cell type 1，TR1）的生成與增殖，并產(chǎn)生對攜帶相同自身抗原APC的抑制作用，促進(jìn)B細(xì)胞分化為具有疾病抑制能力的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞?；趐MHCⅡ的納米制劑屬于全新的策略，可能有助于促使以抗原特異性的方式治療各類ADs。

皮下注射是傳統(tǒng)疫苗的常用給藥途徑之一，免疫效果好。tNPs經(jīng)皮下給藥，可實(shí)現(xiàn)較好的淋巴結(jié)靶向，但該法時(shí)常受限于較小的給藥劑量。

3.4 淋巴結(jié)內(nèi)注射誘導(dǎo)免疫耐受

淋巴結(jié)是最重要的外周免疫器官之一，大量免疫細(xì)胞寄居于其中，是適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生的主要場所，同時(shí)也是T細(xì)胞發(fā)生極化的部位。研究發(fā)現(xiàn)小鼠的大腦中存在能與外周淋巴系統(tǒng)相互聯(lián)系的淋巴管網(wǎng)絡(luò)[40-41]，意味著中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的抗原可能通過該通路遷移至外周引流淋巴結(jié)并引起免疫應(yīng)答，而外周引流淋巴結(jié)也同時(shí)決定著遷移致病灶中的T細(xì)胞類型——促炎或調(diào)節(jié)表型。因此，淋巴結(jié)內(nèi)注射可能會(huì)對CNS類ADs產(chǎn)生更加直接的治療作用，且有助于進(jìn)一步了解局部信號整合與全身免疫耐受之間的特異性聯(lián)系。

MS在解剖學(xué)上與其他ADs的發(fā)病部位不同，該病主要累及腦、脊髓等CNS。馬里蘭大學(xué)的Tostanoski等[42]就采用淋巴結(jié)內(nèi)注射的策略成功地在EAE小鼠上誘導(dǎo)出了抗原特異性免疫耐受。其制備了共包載自身抗原MOG35-55與調(diào)節(jié)信號雷帕霉素的PLGA微粒，在疾病高峰期只經(jīng)1次腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射，就能永久性逆轉(zhuǎn)EAE小鼠的癱瘓癥狀。同時(shí)伴隨著Treg增加以及T細(xì)胞浸潤減少，最終通過重塑淋巴結(jié)內(nèi)局部免疫微環(huán)境驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)性的抗原特異性免疫耐受發(fā)生。但淋巴結(jié)內(nèi)給藥存在操作復(fù)雜、技術(shù)難度大、不確定性多等缺點(diǎn)，限制了這一策略向臨床的轉(zhuǎn)化。

3.5 靜脈給藥誘導(dǎo)免疫耐受

經(jīng)靜脈注射多肽抗原誘導(dǎo)免疫耐受的研究可以追溯到20世紀(jì)20年代[43]，在臨床前研究中，能有效誘導(dǎo)外周免疫耐受。以NPs作為載體經(jīng)靜脈途徑遞送自身抗原或抗原與免疫調(diào)節(jié)劑，能增加藥物的靶向能力、延長作用時(shí)間并減小毒性[44]。靜脈注射后，NPs經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)至右心室，并經(jīng)肺毛細(xì)血管返回左心室，然后富集于微血管滲透性高的器官與組織中，例如肝、脾、腎、腫瘤以及炎癥病灶等[45]。值得一提的是，在腫瘤或炎癥病灶中，通常會(huì)形成由多種免疫細(xì)胞聚集而成的淋巴細(xì)胞簇，又被稱為異位淋巴結(jié)構(gòu)（ectopic lymphoid structure，ELS），ELS屬于外周免疫組織的一部分，承擔(dān)著病灶部位的部分免疫響應(yīng)[46-47]。因此，tNPs富集于ELS[48]、脾等外周免疫器官，將有助于治療分子與免疫細(xì)胞發(fā)生充分作用，誘導(dǎo)免疫耐受發(fā)生。經(jīng)靜脈途徑誘導(dǎo)免疫耐受是近年來的研究熱點(diǎn)，納米載體的構(gòu)建也呈現(xiàn)出多樣性，常用的有PLGA、NEs、脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LNP）、脂質(zhì)體以及外泌體等。

3.5.1 納米類誘導(dǎo)固有免疫耐受磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是細(xì)胞膜磷脂的成分之一，位于細(xì)胞膜內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)的PS翻轉(zhuǎn)至膜外，隨后向體內(nèi)具有吞噬作用的細(xì)胞發(fā)送請求被清除的信號，或者通過促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子TGF-β1的分泌而激活PS受體與巨噬細(xì)胞c-mer酪氨酸激酶（macrophage c-mer tyrosine kinase，MERTK）受體，該系列過程并不會(huì)觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的正向應(yīng)答，而更類似于啟動(dòng)了免疫耐受程序[49-51]。通過模擬機(jī)體自身凋亡細(xì)胞喚醒機(jī)體固有免疫耐受的程序，Roberts等[52]將PS連 接 在PLGA NPs上 形 成PSPLGA，靜脈注射后，成功誘導(dǎo)EAE模型產(chǎn)生了固有免疫耐受，顯著抑制了中樞炎癥的發(fā)展。

3.5.2 mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫耐受 采用LNP遞送mRNA以預(yù)防或治療疾病的技術(shù)在近兩年發(fā)展迅猛。該技術(shù)不僅有助于結(jié)束新冠肺炎的大流行，Krienke等[53]的工作顯示，其還可以誘導(dǎo)MS小鼠模型產(chǎn)生抗原特異性免疫耐受。該團(tuán)隊(duì)采用LNP遞送可以編碼EAE模型疾病相關(guān)抗原MOG35-55的mRNA（nanoparticle-formulated 1 methylpseudouridinemodified messenger RNA，m1Ψ mRNA），這是一種無佐劑的mRNA LNP遞送技術(shù)。靜脈注射后，m1Ψ mRNA靶向脾臟中的CD11c+DC，引起效應(yīng)T細(xì)胞減少，而抗原特異性的Treg數(shù)量顯著上升，并對促進(jìn)疾病發(fā)展的Th1與Th17細(xì)胞產(chǎn)生了抑制作用，從而有效遏制了針對MOG35-55的特異性免疫反應(yīng)。在MS小鼠模型中，該技術(shù)顯著降低了MS的發(fā)病率與嚴(yán)重程度，而并沒有產(chǎn)生全身免疫抑制的相關(guān)癥狀。m1ψmRNA技術(shù)具有高度的靈活性，且成本低廉，這將使通過設(shè)計(jì)含有不同自身抗原序列的個(gè)體化疫苗治療ADs的設(shè)想成為可能。

3.5.3 外泌體誘導(dǎo)免疫耐受髓鞘來源蛋白是MS的主要疾病相關(guān)自身抗原，因此，靜脈注射觸發(fā)EAE的確定髓鞘抗原能誘導(dǎo)免疫耐受，但由于目前尚無法確證MS患者中涉及的具體免疫原，以及可能存在的個(gè)體化差異，使得相關(guān)研究成果的轉(zhuǎn)化受阻。

Casella等[54]研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（oligodendrocyte-derived extracellular vesicles，Ol-EVs）含有多種髓鞘抗原，這些囊泡的粒徑約為240 nm。接著，他們將Ol-EVs靜脈注射給予由不同髓鞘抗原誘導(dǎo)的EAE模型，通過誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的免疫抑制性單核細(xì)胞生成以及自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞凋亡，成功恢復(fù)了模型的免疫耐受狀態(tài)，在預(yù)防性和治療性實(shí)驗(yàn)中均顯示出了良好的安全性與治療效果。更重要的是，研究者發(fā)現(xiàn)人源少突膠質(zhì)細(xì)胞也能釋放EVs，且亦含有與MS緊密相關(guān)的自身抗原，為該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。這一策略的便捷之處在于，它在沒有確定靶抗原的情況下，仍然有機(jī)會(huì)以抗原特異性的方式治療MS。

3.5.4 單載抗原的“致耐受性”納米粒誘導(dǎo)免疫耐受體內(nèi)凋亡細(xì)胞及其碎片易被外周免疫器官中高表達(dá)膠原結(jié)構(gòu)樣巨噬細(xì)胞受體（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO）的巨噬細(xì)胞攝取，并以免疫耐受的方式處理掉。因此，基于自然機(jī)制清除凋亡細(xì)胞碎片的機(jī)制，連接脾白細(xì)胞的自身抗原能誘導(dǎo)發(fā)生抗原特異性免疫耐受[55]，而惰性合成粒子則有可能通過模擬凋亡細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫耐受。Getts等[56]將PLP139-151通過碳二亞胺（ethylene carbodiimide，ECDI）化學(xué)反應(yīng)連接在粒徑約500 nm的聚苯乙烯或PLGA NPs表面，于造模前第7天靜脈給藥1次，就能顯著抑制EAE小鼠的相關(guān)癥狀，且療效優(yōu)于皮下給藥。機(jī)制研究表明，這一療效與“清道夫”受體MARCO表達(dá)增加、Treg水平升高以及誘導(dǎo)T細(xì)胞無能有關(guān)。此外，將供體小鼠脾細(xì)胞裂解后的混合蛋白抗原通過ECDI反應(yīng)連在PLGA NPs表面，經(jīng)靜脈注射，能有效拮抗異體胰島移植引起的受體排異反應(yīng)[57]。

除了脾，肝也是一個(gè)針對大量抗原發(fā)生免疫耐受反應(yīng)的場所[58]，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（sinusoidal endothelial cells，LSEC）是肝APC體系中的重要一員。Liu等[59]在約230 nm的PLGA NPs表面修飾上能靶向LSEC上甘露糖受體或“清道夫”受體的配體，靜脈注射后，能有效抑制OVA特異性IgE反應(yīng)以及Th2型細(xì)胞因子分泌。除了能被用于呼吸系統(tǒng)過敏性疾病的預(yù)防外，LSEC靶向PLGA NPs在ADs的治療領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。

3.5.5 共載抗原與免疫調(diào)節(jié)劑的“致耐受性”納米粒誘導(dǎo)免疫耐受一些小分子化合物能在體內(nèi)外炎性微環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DC（tDC）[60-61]。據(jù)此，將體外誘導(dǎo)生成的自體tDC過繼輸入至患者體內(nèi)能夠產(chǎn)生對某些疾病的治療作用，但高昂的費(fèi)用以及苛刻的生產(chǎn)條件是這類個(gè)體化細(xì)胞療法得以推廣的最大障礙。值得一提的是，NPs作為一種理想的藥物遞送載體，可以通過實(shí)現(xiàn)靶抗原與免疫調(diào)節(jié)分子在體內(nèi)的共同遞送，以誘導(dǎo)內(nèi)源性tDC的產(chǎn)生。截至目前，研究較多的兩類小分子免疫調(diào)節(jié)劑分別是作用于核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的化合物，二者常被用于構(gòu)建各類tNPs。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎癥與細(xì)胞存活相關(guān)基因的主要因子。Capini等[62]研究表明，脂質(zhì)體共遞送抗原與不同的NF-κB抑制劑（如姜黃素、槲皮素以及Bay11-7082），可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的抗原特異性免疫耐受，從而遏制RA模型炎癥發(fā)展。靜脈注射后，載藥脂質(zhì)體被外周免疫器官中的MHCⅡ+APC攝取，通過抑制APC中的NF-κB信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生含有特定抗原信號的tAPC，伴隨誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的Treg。此外，將這些Treg通過靜脈過繼輸入Naive小鼠，可以對受體小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。mTOR是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以通過整合環(huán)境信號來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝與分化。雷帕霉素最早從吸水鏈霉菌的分泌產(chǎn)物中分離得到，在體內(nèi)通過與FK506結(jié)合蛋白結(jié)合形成復(fù)合物而抑制mTOR信號通路，該藥于1999年被美國FDA批準(zhǔn)用于預(yù)防腎移植產(chǎn)生的排異反應(yīng)。雷帕霉素具有強(qiáng)大的抑制T細(xì)胞增殖與免疫系統(tǒng)的能力[63]，F(xiàn)ischer等[64]還發(fā)現(xiàn)該藥在體外可以誘導(dǎo)產(chǎn)生tDC。

Selecta Biosciences公司（SELB）的研究人員等通過篩選大量的小分子免疫調(diào)節(jié)劑，最終發(fā)現(xiàn)包載雷帕霉素的生物可降解PLGA NPs在體內(nèi)外具有很強(qiáng)的免疫耐受誘導(dǎo)能力[8,65-66]，且同時(shí)包載雷帕霉素與蛋白或多肽抗原的tNPs能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的抗原特異性免疫耐受。機(jī)制研究表明，皮下、靜脈或淋巴結(jié)內(nèi)注射后，tNPs優(yōu)先被脾、淋巴結(jié)、異位淋巴結(jié)構(gòu)等外周免疫器官中的APC選擇性優(yōu)先攝取[42,48,65]，隨后誘導(dǎo)產(chǎn)生tAPC與Treg，伴隨抑制效應(yīng)CD4+或CD8+細(xì)胞生成[67]。因此，這種包載抗原與雷帕霉素的tNPs能有效糾正由T細(xì)胞介導(dǎo)的多類異常免疫應(yīng)答，尤其在治療EAE的實(shí)驗(yàn)中，tNPs能有效逆轉(zhuǎn)小鼠模型疾病高峰期的癱瘓癥狀[42,65]。并且，取已發(fā)生免疫耐受的供體小鼠體內(nèi)的Treg，過繼輸入受體小鼠體內(nèi)，將有助于受體小鼠建立針對特定抗原的免疫耐受[68]。

近期，筆者所在團(tuán)隊(duì)正在探索這一策略用于治療RA的潛力，并取得了部分進(jìn)展。以新型NEs作為載體，共遞送雷帕霉素與瓜氨酸化的抗原肽至炎癥關(guān)節(jié)處的異位淋巴結(jié)構(gòu)中，成功在CIA與佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis，AIA）小鼠模型上誘導(dǎo)出了免疫耐受，遏制了RA炎癥發(fā)展[48]；并且，還開發(fā)了一種共載雷帕霉素與瓜氨酸化的抗原肽的“致耐受性多肽疫苗”（tolerogenic polypeptide vaccine，TPvax），經(jīng)靜脈注射后，CIA大鼠模型體內(nèi)的Treg、IL-10顯著上調(diào)，而炎性細(xì)胞因子與抗體水平則下降明顯，重新在RA模型上建立了免疫平衡[69]。

此外，包載雷帕霉素和抗原的tNPs能抑制B細(xì)胞活化、生發(fā)中心形成以及抗體產(chǎn)生。因此，這類tNPs可以有效控制過敏模型中由IgE或IgG介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，并能遏制采用生物制劑治療時(shí)藥物特異性抗體的形成。例如，生物藥Advate聯(lián)合包載雷帕霉素的tNPs，能降低血友病A小鼠模型體內(nèi)的FⅧ特異性抗體水平，從而顯著提高Advate的生物利用度[70]；運(yùn)用該法還能有效下調(diào)RA模型中人源TNF-α抑制劑阿達(dá)木單抗的特異性抗體水平[67]，并降低龐貝病模型中酸性α-葡萄糖苷酶的抗體濃度[71]。SELB開發(fā)的用于治療慢性難治性痛風(fēng)由包載雷帕霉素的tNPs與聚乙二醇化重組尿酸氧化酶組成的聯(lián)合療法SEL-212，已于2020年7月在美國展開了Ⅲ期臨床研究（NCT04513366、NCT04596540）。

4 結(jié)語與展望

與早期采用游離抗原誘導(dǎo)免疫耐受以治療ADs的困境相似，免疫調(diào)節(jié)性納米制劑通常在動(dòng)物模型上效果顯著，而相關(guān)的臨床試驗(yàn)往往效果甚微[6]。這種差異是其臨床轉(zhuǎn)化面臨的最大挑戰(zhàn)，而可能的原因有以下幾方面：首先，ADs的動(dòng)物模型不能完全模擬患者的病理機(jī)制。例如，EAE小鼠模型的建立是通過單次注射特定抗原而誘發(fā)的急性病理過程，而人類MS則是一種慢性的多誘因疾病。其次，人類ADs的疾病相關(guān)自身抗原尚未完全明確。例如，RA患者涉及的相關(guān)自身抗原包括二型膠原蛋白、熱休克蛋白、軟骨糖蛋白39、系列瓜氨酸化的蛋白/多肽以及病原微生物抗原等，參與抗原種類復(fù)雜。而廣泛用于臨床前研究的RA鼠科模型則采用特定的蛋白抗原與完全弗氏佐劑組成的混合物誘導(dǎo)而成，常用的有異源二型膠原蛋白、蛋白聚糖等[72]，抗原明確且單一。另外，納米藥物在動(dòng)物與人體內(nèi)的分布差異可能會(huì)影響免疫耐受的效果。此外，相比于模型動(dòng)物，人類MHC等位基因與TCR更具多態(tài)性，不同ADs患者所涉及的優(yōu)勢自身抗原表位可能存在差異，這是基于特定多肽的免疫療法療效有限的又一潛在原因[8]。

然而，挑戰(zhàn)即是機(jī)遇。隨著免疫學(xué)、藥劑學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，將會(huì)有更適用于研究免疫耐受療法的動(dòng)物模型、新型抗原、遞送載體被開發(fā)出來。目前，已有人源化的RA小鼠模型被用于臨床前研究[73]，這些模型一般通過兩種方式獲得：一種是含有人類RA相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，包括人類MHC分子、TCR以及自身抗原等；另一種是將人類細(xì)胞或組織植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，制備成小鼠-人類嵌合體模型。此外，髓鞘全抗原的應(yīng)用正在突破由MS動(dòng)物模型向臨床轉(zhuǎn)化的瓶頸[54]，用于預(yù)防新冠肺炎的Comirnaty與Spikevax在人群中的大規(guī)模接種進(jìn)一步驗(yàn)證了LNP技術(shù)的安全與有效性。這些技術(shù)的進(jìn)步將促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)納米制劑的發(fā)展。相信在不久的將來，基于tNPs的平臺技術(shù)將會(huì)被成功用于治療ADs，與現(xiàn)有的治療策略形成互補(bǔ)，減輕患者痛苦，改善患者生活質(zhì)量。