王宗隅，范琦強(qiáng)，趙 艷，王艷紅，羅琰琨，周 蕓

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院(山西省人民醫(yī)院)腎內(nèi)科，山西 太原 030012；2.腎臟病山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030012；3.山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因工程研究中心，山西 太原 030012；4.山西醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室，山西 太原 030001)

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是全球最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，也是慢性腎臟病和終末期腎病的重要原因[1]。我國(guó)是IgAN的高發(fā)國(guó)家，約30%～40%的患者在確診后20年內(nèi)進(jìn)行性發(fā)展為終末期腎臟病，最終只能依靠透析或腎移植治療[1]。目前，IgAN的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，較為公認(rèn)的是多重打擊學(xué)說，與黏膜免疫的異常密切相關(guān)[2]。同時(shí)，IgAN血管病變發(fā)生率高，隨疾病進(jìn)展而加重，作為影響疾病預(yù)后的重要因素，受到廣泛關(guān)注[3]。

中介素(intermedin，IMD)，又稱腎上腺髓質(zhì)素，屬于降鈣素基因相關(guān)肽超家族成員，可通過該家族共同受體系統(tǒng)的不同亞型非選擇性結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。研究提示[5]，IMD在腎臟中有大量表達(dá)，其參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、血管腔形成及血管新生，并抑制腎臟纖維化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者腎臟血管的丟失與IMD密切相關(guān)，且在不同病理分級(jí)或分期中呈現(xiàn)一定變化趨勢(shì)，提示IMD在IgAN的進(jìn)展中可能有一定作用[6]。因此，本研究通過構(gòu)建IgAN大鼠模型，觀察IMD對(duì)IgAN大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能以及微血管損傷的影響，以期為IgAN的非免疫治療提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大鼠中介素(IMD，杭州中肽生化公司，批號(hào)HITM002)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)V900933)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)L2880)；四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4，上海羅恩試劑公司，批號(hào)R019799)、蓖麻油(上海羅恩試劑公司，批號(hào)R019726)；微量滲透泵(美國(guó)Alzet公司，批號(hào)2004)；HE染色、PAS染色(武漢賽維爾生物科技有限公司)；一抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號(hào)A16640、A17910、A0697、A11492、A2125、A12303)及二抗(武漢博士德生物公司，批號(hào)SV0002-12)；PCR引物設(shè)計(jì)合成(上海生工生物公司)；PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號(hào)RR047A，RR820A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♂SD大鼠，6周齡，共36只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物中心使用許可證號(hào)為SYXK(晉)2019-0003。本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均符合山西省人民醫(yī)院動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1IgA腎病大鼠模型的建立 采用口服牛血清白蛋白(BSA)+尾靜脈注射脂多糖(LPS)+皮下注射四氯化碳(CCl4)的方法建立IgA腎病大鼠模型。BSA結(jié)晶粉末以蒸餾水稀釋為100 g·L-1的濃度，按6 mL·kg-1的量，隔日灌胃，持續(xù)12周；LPS用0.9%生理鹽水稀釋成0.25 g·L-1的濃度，按1 mL·kg-1的量，于第6周、第8周、第10周、第12周尾靜脈注射；CCl4和蓖麻油按每只0.1 mL+0.3 mL的量每周皮下注射1次，共12周。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及藥物處理將36只大鼠隨機(jī)分組如下：正常對(duì)照組(Control組)、IgA腎病組(IgAN組)、正常對(duì)照+IMD組(Control+IMD組)以及IgA腎病+IMD組(IgAN+IMD組)，每組9只。IgAN組根據(jù)上述方法造模，Control組給予等量的生理鹽水，12周末將Control組及IgAN組分別處死3只大鼠，留取腎組織，評(píng)估造模情況。IMD溶解后注入微量滲透泵，將麻醉大鼠，把泵埋入其背部的皮下，按100 ng·kg-1·h-1給藥[7]，持續(xù)4周。

1.3.3 腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)的第6、12和16周末，將各組大鼠分別放入代謝籠中，收集大鼠24 h的尿液，采用全自動(dòng)尿液分析儀檢測(cè)尿蛋白量。16周末經(jīng)大鼠心尖部取血2～4 mL，離心后留取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)。

1.3.4觀察腎臟病理改變 腎組織用4%的多聚甲醛溶液來固定，待固定狀態(tài)良好后，用酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋等。分別行HE、PAS染色后封片，在顯微鏡下觀察、攝片。

1.3.5免疫熒光觀察腎小球IgA沉積 腎組織進(jìn)行連續(xù)切片，封閉、干燥后滴加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgA抗體(1 ∶100)置于暗盒中4 ℃過夜，放置室溫晾干并進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察、攝片。

1.3.6RT-PCR法檢測(cè)血管損傷與修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) 用TaKaRa試劑盒提取腎組織RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各基因表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of RT-PCR

1.3.7 Western blot檢測(cè)血管損傷與修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)將收集的腎臟組織加入100 μL的裂解液，超聲波破碎組織20 s，后冰上靜置30 min，低溫高速離心15 min，取上清至新的EP管，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)齊后低溫保存?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳約1.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h，脫脂牛奶封閉2 h，分別加入對(duì)應(yīng)的一抗(1 ∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL(A液 ∶B液=1 ∶1)化學(xué)發(fā)光液均勻滴于條帶上，成像儀曝光，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 中介素明顯減少IgAN大鼠24 h尿蛋白水平造模前各組大鼠尿蛋白保持在較低水平。與Control組相比，IgAN組大鼠第6周已經(jīng)出現(xiàn)少量尿蛋白，后顯著升高，并持續(xù)至16周末(P<0.01)；與IgAN組相比，IMD干預(yù)治療后大鼠尿蛋白明顯降低(P<0.01)，見Tab 2。

2.2 中介素對(duì)IgAN大鼠腎臟功能的影響第16周末，與Control組相比，IgAN組大鼠Scr略微升高(P<0.05)；與IgAN組相比，IMD干預(yù)治療后大鼠Scr降低(P<0.05)；各組大鼠BUN未見明顯改變(P>0.05)，見Fig 1。

2.3 中介素減輕IgAN大鼠腎臟病理損傷HE和PAS染色可見，Control組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常；IgAN組大鼠系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，腎小管萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張，周圍可見結(jié)締組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；與IgAN組相比，IMD干預(yù)治療后大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)減少，腎小管損害減輕，見Fig 2。

2.4 中介素減少IgAN大鼠腎小球IgA沉積熒光顯微鏡下，Control組大鼠腎小球系膜區(qū)未見IgA沉積；與Control組相比，IgAN組大鼠系膜區(qū)可見大量IgA沉積；與IgAN組相比，IMD干預(yù)治療后大鼠系膜區(qū)IgA沉積減少，見Fig 3。

Tab 2 The urine protein quantification in different

Fig 1 Levels of serum creatinine and blood urea nitrogen in different *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs IgAN group.

Fig 2 Changes of glomerular mesangial cells and matrix after intermedin intervention(×400)

Fig 3 IgA deposition in glomerular mesangial area after intermedin intervention(×400)

2.5 中介素對(duì)IgAN大鼠腎組織血管損傷與修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)反映腎臟纖維化的程度，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)反映腎臟血管的生成與丟失。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，IgAN組TGF-β1、α-SMA、TSP-1的mRNA和蛋白表達(dá)均高于Control組(P<0.05)，經(jīng)IMD干預(yù)后，3者的表達(dá)均降低(P<0.05)；IgAN組BMP-7、E-cadherin、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)均低于Control組(P<0.05)，經(jīng)IMD干預(yù)后，3者的表達(dá)均升高(P<0.05)，見Fig 4，F(xiàn)ig 5。

Fig 4 The mRNA levels of TGF-β1，α-SMA，BMP-7，E-cadherin， TSP-1 and VEGF after intermedin n=6)*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs IgAN group.

3 討論

IgAN的主要病理特征是以IgA為主的免疫復(fù)合物顆粒樣或團(tuán)塊狀沉積伴腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)擴(kuò)張[1]。尿蛋白是IgAN患者最常出現(xiàn)的臨床癥狀，同時(shí)也是引起腎小管間質(zhì)損害、導(dǎo)致腎功能進(jìn)展的因素之一[1]。本研究采用國(guó)內(nèi)最常用的方法，即聯(lián)合牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳建立IgAN大鼠模型[8-9]。免疫熒光可見IgAN組大鼠系膜區(qū)出現(xiàn)IgA沉積，HE和PAS染色可見系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，尿蛋白定量結(jié)果顯示其尿蛋白水平較對(duì)照組明顯升高，符合IgAN的特點(diǎn)。經(jīng)IMD干預(yù)后，大鼠尿蛋白水平下降，腎小球IgA沉積減少，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生程度減輕，提示IMD對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)IgAN組大鼠血肌酐水平略高于對(duì)照組，而血尿素氮水平變化不明顯，可能與造模期IgAN大鼠腎臟損傷不夠嚴(yán)重有關(guān)。

Fig 5 The protein levels of TGF-β1，α-SMA，BMP-7，E-cadherin， TSP-1 and VEGF after intermedin *P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs IgAN group.

IMD作為血管活性物質(zhì)具有促進(jìn)血管生成、維持血管正常形態(tài)和功能的作用[5]，本研究進(jìn)一步觀察了IMD對(duì)血管損傷與修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。腎臟微血管病變與纖維化進(jìn)展共存，當(dāng)微血管減少時(shí)纖維化進(jìn)行性加重。TGF-β1是腎纖維化的重要因子，也是腎微血管系統(tǒng)的關(guān)鍵介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等作用，可上調(diào)α-SMA的表達(dá)[10]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的主要表型標(biāo)志，當(dāng)其表達(dá)增多時(shí)可引起組織纖維化、內(nèi)皮功能障礙[11]，進(jìn)而導(dǎo)致腎組織缺血。BMP-7是TGF-β超家族成員，在腎臟主要分布在足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中，其可通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗纖維化作用[12]。有研究表明[13]，BMP-7可激活Smad1/5依賴性途徑抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)減少E-cadherin的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IgAN組TGF-β1與α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，BMP-7的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，經(jīng)IMD干預(yù)后，TGF-β1與α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，BMP-7的mRNA和蛋白表達(dá)水平則升高。由此推測(cè)，IMD可通過調(diào)節(jié)促纖維化因子與抗纖維化因子的表達(dá)來共同減輕腎臟纖維化，從而延緩IgAN的進(jìn)展。

E-cadherin是鈣依賴性的跨膜蛋白，參與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，在維持血管的極性和完整性方面具有關(guān)鍵作用，E-cadherin的減少或缺失也是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要特征[14]。VEGF作為血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，增加血管通透性等作用[15]。TSP-1是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，通過多種方式抑制新生血管的生成。研究表明，TSP-1能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來限制VEGF從細(xì)胞外基質(zhì)釋放，也可通過阻斷VEGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制血管生成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)[17]，與對(duì)照組相比，IgAN組TSP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升，而E-cadherin與VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，經(jīng)IMD干預(yù)后TSP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，E-cadherin與VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高。既往研究發(fā)現(xiàn)[18]，腎臟血管的丟失和纖維化均與VEGF和TSP-1的表達(dá)改變相關(guān)，而IMD可通過VEGF信號(hào)通路參與血管生成的調(diào)節(jié)。由此推測(cè)，IMD可通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來調(diào)節(jié)促纖維化因子與抗纖維化因子的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)并減少TSP-1的表達(dá)來減輕腎臟微血管損傷和纖維化，起到保護(hù)腎臟的作用。

綜上所述，IMD能夠減少IgA在腎小球系膜區(qū)沉積，并調(diào)節(jié)血管損傷與修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來維持血管的功能，延緩IgAN進(jìn)展，但其與免疫機(jī)制的相關(guān)關(guān)系仍需進(jìn)一步研究闡明。