王 群，馬 飛，王學斌，馬月香，孫世光

(山東中醫(yī)藥大學 1.中醫(yī)學院、2.附屬醫(yī)院、3.第二附屬醫(yī)院，山東 濟南 250001；4.濟南市市中區(qū)人民醫(yī)院眩暈科，山東 濟南 250002；5.山東省中醫(yī)院，山東 濟南 250014；6.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 濟南 250001)

焦慮癥是最常見的精神障礙，臨床常與其他類精神障礙合并共存；2019年全球疾病負擔研究發(fā)現(xiàn)，焦慮癥是導致10～24歲青少年傷殘調(diào)整生命年的第六位主要疾病[1-2]。明暗箱實驗(light/dark box，LDB)是狀態(tài)焦慮動物模型行為學評價的經(jīng)典方法，廣泛用于焦慮癥發(fā)病機制與藥物篩選研究；嚙齒類實驗動物LDB焦慮情緒主要是基于明暗光線刺激沖突產(chǎn)成，其行為模式受實驗裝置(形狀、材質(zhì)、尺寸等)、實驗動物(品系、年齡、性別等)及實驗操作(起始位置、記錄時間、重測測量及周期節(jié)律等)諸多因素影響[3-4]。因此，本研究依據(jù)LDB作為狀態(tài)焦慮動物模型的評價方法與原理，初步探討晝夜節(jié)律、光照面積、光照顏色以及光照強度等因素對昆明小鼠LDB行為模式的影響，以期篩選出LDB作為狀態(tài)焦慮動物模型評價方法的穩(wěn)定實驗條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物昆明小鼠，雄性(♂)，由山東大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(魯)20130001；室溫(20±2)℃，黑暗12 h(6 ∶00～18 ∶00)和光照12 h(18 ∶00～6 ∶00)環(huán)境，自由進水飲食飼養(yǎng)；預適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量(20±2)g小鼠進入正式實驗。

1.2 實驗裝置明暗箱(45 cm × 27 cm × 27 cm)，木質(zhì)，包括3部分：大面積箱體(27 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成9個面積相等的方格(9 cm × 9 cm)；小面積箱體(18 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成6個面積相等的方格(9 cm × 9 cm)；兩箱體隔板(可移動)之中央通道(7 cm × 7 cm)。明箱區(qū)采用30 W白燈泡離箱底40 cm高處照明；暗箱區(qū)采用30 W紅燈泡(或其他實驗彩色)離箱底40 cm高處照明。

1.3 實驗操作操作者將昆明小鼠置于大面積箱體正中央格，用攝像系統(tǒng)記錄動物5 min的行為變化，包括兩箱停留時間、水平運動、垂直運動、穿梭次數(shù)以及糞便粒數(shù)；其中，四只爪子均進入一格方可記錄水平運動1次，兩前爪騰空或攀附墻壁方可記錄垂直運動1次。納入實驗參數(shù)：明區(qū)停留時間百分率(Ltime%)、明區(qū)水平運動百分率(Lcross%)、明區(qū)垂直運動百分率(Lrear%)、水平運動總得分(Cross)、垂直運動總得分(Rear)、總得分(Total=Cross+Rear)、穿梭次數(shù)(Transition)和兩區(qū)糞便粒數(shù)(Lfbs，Dfbs)及糞便總粒數(shù)(Fbs=Lfbs+Dfbs)。

1.4 實驗條件LDB實驗條件影響因素主要考察晝夜節(jié)律(白天黑夜)、光照面積(明箱區(qū))、光照顏色(暗箱區(qū))、光照強度(明箱區(qū))以及晝夜節(jié)律與光照面積交互效應(yīng)。其中，晝夜節(jié)律主要考察白天周期(18 ∶00～6 ∶00；Day)、黑夜周期(6 ∶00～18 ∶00；Night)對實驗動物LDB行為模式影響；光照面積主要考察眀箱區(qū)光照大面積箱體(L3/5)、小面積箱體(L2/5)對實驗動物LDB行為模式影響；晝夜節(jié)律與光照面積采用析因設(shè)計分組：Day-L3/5(n=6)，Day-L2/5(n=6)，Night-L3/5(n=6)，Night-L2/5(n=6)。光照顏色主要考察暗箱區(qū)光照顏色黃色(Yellow，n=6)、綠色(Green，n=6)、藍色(Blue，n=6)、紅色(Red，n=6)對實驗動物LDB行為模式影響，明箱區(qū)采用30 W白燈泡光照；實驗周期選取Night。光照強度主要考察眀箱區(qū)光照強度15 W(n=6)、25 W(n=6)、40 W(n=6)、60 W(n=6)、100 W(n=6)對實驗動物LDB行為模式影響，暗箱區(qū)采用30 W紅燈泡光照；實驗周期選取Night。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0 for Windows軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計作圖。Kolmogorov-Smirnov檢驗由Analyze→Nonparametric Tests→One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test程序完成；Levene檢驗由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA(Homogeneity of Variances Test)程序完成。t檢驗由Analyze→Compare Means→One-SampleTTest/Independent-SamplesTTest程序完成；單因素ANVOA由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA程序完成；析因設(shè)計ANVOA由Analyze→General Linear Model→Univariate程序完成；Kruskal-Wallis檢驗Analyze→Nonparametric Tests→K-Independent-Samples Tests。所有數(shù)據(jù)先進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗和Levene方差齊性檢驗；依據(jù)正態(tài)分布結(jié)果進行t檢驗/單因素ANOVA/析因設(shè)計ANOVA/Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義[5-6]。

2 結(jié)果

2.1 晝夜節(jié)律Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Cross、Rear、Total數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。t檢驗結(jié)果提示，與黑夜周期相比，白天周期LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs差異變化均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 1。

2.2 光照面積Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Total、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。t檢驗結(jié)果提示，與3/5相比，光照大面積箱體(L3/5)LDB實驗參數(shù)Lcross%(Day：t=5.363，P<0.01)升高，且差異具有統(tǒng)計學意義；與2/5相比，光照小面積箱體(L2/5)LDB實驗參數(shù)Lrear%(Day：t=3.211，P<0.05)升高，且差異具有統(tǒng)計學意義。進一步析因設(shè)計ANOVA結(jié)果提示，晝夜節(jié)律對LDB實驗參數(shù)影響差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而光照面積對LDB實驗參數(shù)Ltime%(F(1，20)=18.361，P<0.01)、Lcross%(F(1，20)=49.148，P<0.01)、Lrear%(F(1，20)=8.424，P<0.01)影響差異具有統(tǒng)計學意義；晝夜節(jié)律與光照面積對LDB實驗參數(shù)存在交互作用影響，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 1。

2.3 光照顏色Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。單因素ANOVA結(jié)果提示，光照顏色對LDB實驗參數(shù)Rear(F(3，20)=3.746，P<0.05)、Fbs(F(3，20)=3.585，P<0.05)影響效應(yīng)差異具有統(tǒng)計學意義；Dunnettt檢驗結(jié)果提示，與Red組相比，Yellow組LDB實驗參數(shù)Rear(MD=-30.833，P<0.05)顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義；Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果提示，光照顏色對Lfbs、Dfbs影響效應(yīng)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 2。

2.4 光照強度Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗提示，LDB實驗參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。單因素ANOVA結(jié)果提示，光照強度對LDB實驗參數(shù)Cross(F(4，25)=2.569，P<0.05)、Total(F(4，25)=2.588，P<0.05)影響效應(yīng)差異具有統(tǒng)計學意義；Dunnettt檢驗結(jié)果提示，與15 W組相比，100 W組LDB實驗參數(shù)Cross(MD=-173.167，P<0.05)、Total(MD=-93.667，P<0.05)明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義；Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果提示，光照強度對Lfbs、Dfbs影響效應(yīng)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Effect of day-night rhythm and illumination area on behavioral pattern of light/dark box(n=24)Solid bars，dark cycle;Hollow bars，light cycle;Wide bars，light at L3/5 area;Narrow bars，light at L2/5 area.*P<0.05，#P<0.01 vs Wide bars.

Fig 2 Effect of illumination color (in Dark box) on behavioral pattern of light/dark box♂ n=24.*P<0.05 vs Red light.

Fig 3 Effect of illumination intensity (in Light box) on behavioral pattern of light/dark box(n=30)*P<0.05 vs 15 W.

3 討論

外界環(huán)境(光線、噪音、清潔度等動物福利)可以明顯影響實驗動物行為與生理變化，并導致實驗數(shù)據(jù)波動變異[7-8]。已有研究證實[9-10]，嚙齒類實驗動物視覺系統(tǒng)對紫外光區(qū)與中波長可見光區(qū)(綠光)敏感，而對紅光及紅外光區(qū)不敏感，這可能與嚙齒類實驗動物視覺系統(tǒng)是二元色，視網(wǎng)膜缺乏識別紅光錐體細胞相關(guān)；然而，最新研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，嚙齒類實驗動物行為與生理受光線影響(包括紅光)，這可能與嚙齒類實驗動物行為與生理受視覺、觸覺、聽覺以及交感神經(jīng)系統(tǒng)等不同神經(jīng)通路交互式傳遞、不同腦區(qū)分布式編碼控制有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，光照面積可明顯影響LDB焦慮行為模式(Ltime%、Lcross%、Lrear%)，且光照面積通過晝夜節(jié)律影響LDB焦慮行為模式，尤其是與明箱區(qū)空間面積相比，白天周期LDB焦慮行為(Lcross%、Lrear%)明顯增加；光照顏色(黃光)可明顯影響LDB探索行為模式(Rear)，光照強度(100 W)可明顯影響LDB運動行為模式(Cross、Total)。同時，嚙齒類動物情緒行為的形成與表達與先天遺傳與后天環(huán)境密切相關(guān)[18]，而狀態(tài)焦慮評價受外界環(huán)境及操作條件等后天因素的影響更為明顯，應(yīng)注意到本研究可能存在的缺陷：①晝夜顛倒預適應(yīng)環(huán)境周期僅1 w；②光照顏色是通過燈罩顏色過濾獲??；③光照強度采用燈泡功率大小區(qū)分；上述因素亦可能導致LDB行為模式一定程度的偏移。