楊澤岸，陳 晨，張 媛，王 燦，高 華，吳彥霖

(1.中國食品藥品檢定研究院 北京 102629 2.上海食品藥品檢驗所,上海 201203)

疫苗質(zhì)量安全問題也日益受到公眾關(guān)注，其中熱原反應(yīng)(pyrogen reaction)是臨床常見的不良反應(yīng)之一。熱原反應(yīng)系經(jīng)非腸道給藥0.5～1 h內(nèi)出現(xiàn)的冷顫、高熱、出汗、昏暈、嘔吐，甚至休克等現(xiàn)象，能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)稱為熱原[1]。熱原包括細菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。藥物中的熱原物質(zhì)主要指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產(chǎn)物、細菌外壁及內(nèi)毒素(endotoxin)。細菌內(nèi)毒素，又稱脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，是革蘭陰性菌的產(chǎn)物，其致熱能力最強[2]。熱原檢查方法包括家兔熱原檢查法(rabbit pyrogen test，RPT)、細菌內(nèi)毒素檢查法(bacterial endotoxin test，BET)和單核細胞激活實驗(monocyte activation assay，MAT)[3-9]。

基于ISO 17025 的規(guī)范性文件中關(guān)于方法學(xué)驗證的內(nèi)容，各國藥品監(jiān)管機構(gòu)發(fā)布的指導(dǎo)原則提出了方法驗證(method validation)、方法轉(zhuǎn)移(method transfer)和方法確認(rèn)(method verification)的概念，用于保證檢驗方法適合于檢驗、被檢樣品的質(zhì)量可控，并確保檢驗人員有能力去操作方法，根據(jù)目的、檢驗人員、檢驗環(huán)境等因素的不同，以上3個概念的內(nèi)涵和側(cè)重點又有所不同。method validation的核心是實驗室通過試驗設(shè)計和測試，證明被驗證的方法適用于該方法擬定的檢測用途。method validation主要由方法建立者進行，方法建立者必須要證明所建立的方法能夠滿足期望的檢測用途。method transfer是一個實驗室建立了經(jīng)過驗證的分析方法，當(dāng)其他實驗室(方法接收實驗室)在使用這個方法進行檢驗檢測時，就牽涉到方法在2個及以上不同實驗室之間的轉(zhuǎn)移問題，接收方法的實驗室需要證明其能夠成功地在本實驗室中運行該方法。常見的method transfer有：分析方法由公司的研發(fā)實驗室轉(zhuǎn)移到質(zhì)控實驗室[10-12]。在方法的協(xié)作標(biāo)定過程中，協(xié)作單位接收組織者提供的HL-60-IL-6單核細胞激活實驗方法[13-14]，并基于組織者的要求進行方法關(guān)鍵指標(biāo)的測試和研究，協(xié)助完成方法的建立和驗證，上述環(huán)節(jié)涉及method transfer和method validation兩個環(huán)節(jié)。因此，我們首先按照組織者要求對LPS刺激HL-60分泌IL-6法進行了方法的transfer和validation，并使用經(jīng)過validation的方法進行了人狂犬疫苗的品種適用性研究。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑細胞：人早幼粒白血病細胞HL-60，中國科學(xué)院細胞庫，細胞及鑒定結(jié)果由上海藥檢所提供[16]。

試劑：胎牛血清、IMDM、胰酶(Gibco公司，批號1347556、1897074、1095511)；人白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(BD OptEIATM公司，批號7118747EU；R&D公司，批號P134546；欣博盛生物科技有限公司，批號H170523-003a和H190716-007a)；LPS國家標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號150800-201601)；凍干人用狂犬病疫苗：10個廠家13批及熱原不合格樣品對應(yīng)的3批疫苗附的注射用水(16批樣品)。

1.2 主要儀器CKX 41倒置顯微鏡(Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；6R離心機(Beckman Coulter公司)：Z2細胞計數(shù)儀(Beckman Coulter公司)；SYNERGY MX和SYNERGY HT酶標(biāo)儀(Biotek公司)。

1.3 方法

1.3.1方法轉(zhuǎn)移 1)LPS 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 在無菌條件下，將LPS國家標(biāo)準(zhǔn)品用細菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶至10 000 EU·mL-1，在渦旋混合器上混勻15 min，用維持培養(yǎng)液稀釋成0，0.015 6，0.031 2，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1.0，10，100 EU·mL-1一系列濃度，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30 s。2)細胞檢測體系的建立 取對數(shù)生長期細胞，穩(wěn)定傳代2～3次，調(diào)整HL-60細胞密度至每1 mL約含1.0×105～1.0×106個細胞，于20%胎牛血清的IMDM細胞培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。選擇8～20代次的細胞用于實驗。取細胞懸液適量，1 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，用維持培養(yǎng)液(含2%FBS的IMDM培養(yǎng)基)調(diào)整細胞密度為每1 mL約含1.0×106個細胞，100 μL每孔接種于96孔U型板，加入100 μL 3.1或供試品溶液，平行3孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，取細胞上清，使用ELISA試劑盒檢測IL-6含量，計算450 nm處的吸光度A值與LPS濃度的關(guān)系，即為HL-60 MAT實驗檢測體系。

1.3.2方法驗證 參考2015年版《中國藥典》四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，對方法的線性及范圍、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、耐用性進行驗證[17]。

1)線性 以LPS濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A值為縱坐標(biāo)進行四參數(shù)擬合。R2不得低于0.95，計算該體系對應(yīng)的最低檢測限。最低檢測限=空白孔實測平均A值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(+3 s)。

2)重復(fù)性 取1名人員3次獨立實驗結(jié)果，3次最低檢測限結(jié)果應(yīng)不超過50%～200%。

3)準(zhǔn)確度 在維持培養(yǎng)基中加入接近反應(yīng)曲線 EC50的LPS濃度溶液作為添加已知的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，配制方法同3.2，計算回收率%。

回收率%=(實測值-溶液中所含被測成分值)/加入標(biāo)準(zhǔn)品量×100%

4)耐用性 細胞自購買起為1代，建庫留種，取8、16、21和24代細胞進行靈敏度檢測，考察指標(biāo)為最低檢測限；考察2家公司的IL-6 ELISA檢測試劑盒對檢測結(jié)果的影響。

1.3.3凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細胞激活實驗檢測 選用10個廠家共計13批次樣品，對其中RPT和BET檢測不合格的樣品附帶的注射用水3批進行檢查，按照《中國藥典》品種項下進行最大稀釋倍數(shù)MVD的計算，按照公式L=K·M-1，確定供試品的熱原物質(zhì)限值(L)。其中，K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU·(kg·h)-1表示，注射劑K=5 EU·(kg·h)-1，M為人用每千克體重的最大供試品劑量，以mL·(kg·h)-1、mg·(kg·h)-1或U·(kg·h)-1表示，中國人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算。注射時間若不足1 h，按1 h計算。按照L按照標(biāo)準(zhǔn)每劑不得大于25EU，規(guī)格為0.5 mL和1.0 mL。按照公式MVD=C·L/·λ-1，λ為檢測體系的最低檢測限，每一步稀釋比不得大于1 ∶10，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30秒[18]。

1.3.4細菌內(nèi)毒素動態(tài)顯色測定法 按《中國藥典》四部(2015 版)[18]通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法項中光度測定法進行凍干人用狂犬病疫苗的細菌內(nèi)毒素含量檢測。

1.3.5熱原檢查法按《中國藥典》四部(2015 版)[19]通則1142熱原檢查法項進行凍干人用狂犬病疫苗的熱原檢測。

2 結(jié)果

2.1 方法驗證

2.1.1線性 當(dāng)LPS濃度為0、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、10、100 EU·mL-1時，致HL-60細胞分泌的細胞因子IL-6含量的吸光度A值通過logistic四參數(shù)回歸，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系(Fig 1)，R2值均>0.95。

Fig 1 Dose-response relationship of IL-6 secretion byHL-60 induced by different concentrations of LPS standard

2.1.2重復(fù)性 使用BD OptEIATM公司和R&D公司生產(chǎn)的人IL-6 ELISA試劑盒分別進行3次試驗，計算R2值和最低檢測限。2個廠家吸光度A值差異比較大，但通過試劑盒自帶標(biāo)曲計算IL-6含量，2個廠家對IL-6含量的檢測一致。表明HL-60-IL-6檢測體系重復(fù)性符合1.3.2要求，最低檢測限的波動范圍在50%～200%之間(Tab 1)。

Tab 1 Linearity and repeatability(n=3，3 independent experiments for 2 manufacturers)

2.1.3準(zhǔn)確度 將LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1作為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入檢測體系，平行6孔，獨立進行5次實驗，檢測體系的LPS含量為0 EU·mL-1，實測值為0.01 EU·mL-1(Tab 2)，LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1的回收率在91%～110%。

2.1.4耐用性 參考重復(fù)性實驗結(jié)果，在比對了BD OptEIATM公司和R&D公司生產(chǎn)的人IL-6 ELISA試劑盒檢測的基礎(chǔ)上，進行欣博盛生物科技有限公司2個批號的人IL-6 ELISA試劑盒檢測，通過logistic四參數(shù)回歸，LPS濃度與HL-60分泌IL-6含量呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系，R2值均>0.95，最低檢測限為0.5和1.0 EU·mL-1，靈敏度與細菌內(nèi)毒素檢查法相比無明顯優(yōu)勢。

Tab 2 Accuracy test results n=6，5 independent experiments for 2 concentrations)

使用R&D公司比較了8、16、20和24代的細胞的靈敏度，24代細胞與8代細胞的吸光度A值相比降低超過80%，最低檢測限分別為0.0625、0.0625、0.5和10 EU·mL-1，且24代細胞0.5、1.0和10 EU·mL-1劑量組間差異無顯著性，基于此，檢測體系建議使用20代次以內(nèi)的HL-60細胞用于單核細胞激活實驗的檢測。

2.2 凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細胞激活實驗《中國藥典》2015年版二部凍干人用狂犬病疫苗品種項下規(guī)定的細菌內(nèi)毒素含量不得超過25 EU·劑-1，檢測體系最低檢測限為0.125 EU·mL-1，參照細菌內(nèi)毒素檢查法中光度測定法中的干擾試驗，以1.0 EU·mL-1作為干擾濃度，計算檢測樣品中的LPS含量(Tab 2)。編號14-16為BET檢驗不合格樣品附帶安瓿裝水，表明HL-60-IL-6法、BET法和RPT法檢測結(jié)論一致。

3 討論

3.1 熱原補充方法的研究為了確保非腸道用藥的質(zhì)量和安全，尤其是靜脈注射用藥，熱原檢測技術(shù)日益至關(guān)重要，各國藥典也相繼收載多種熱原檢測方法，包括家兔熱原檢查法、細菌內(nèi)毒素檢查法和單核細胞激活實驗。RPT被認(rèn)為是檢測熱原的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可全面、直觀反應(yīng)藥物的臨床風(fēng)險，其缺點是不能定量、靈敏度低、結(jié)果重復(fù)性差、費用較高、使用活體動物等，且RPT不適用于放射性藥物、化療藥物、免疫抑制劑等影響家兔發(fā)熱藥物的熱原檢測。BET可半定量或定量檢測藥物中細菌內(nèi)毒素(含量，靈敏度較高，重復(fù)性好，其缺點是只能檢測革蘭陰性菌來源的LPS，不能檢測其他來源的熱原[15]。目前，《英國藥典》、《歐洲藥典》均已收錄了MAT，用于熱原檢測，于2005、2006年已有7種方法分別得到歐洲權(quán)威機構(gòu)的驗證：7種推薦的方法有人全血法(新鮮人全血-IL-1β、新鮮人全血-IL-6和凍存人全血-IL-1β)，人外周血法(PBMC-IL-6)和細胞系法(MM6-IL-6、THP1-新喋呤(Neo)、THP1-TNFα)[17]。其中，人全血和人外周血對人血的要求較高，而且來源困難。而細胞系法中推薦的兩株細胞MM6和THP-1-新喋呤(Neo)細胞無法獲得，限制了該方法的推廣應(yīng)用。

Tab 3 Results of freeze-dried human rabies vaccine HL-60-IL-6 method，BET method and RPT method

此外，細菌內(nèi)毒素檢查法須使用專用試劑—鱟試劑系從國家二級保護動物鱟體內(nèi)血液提取，由于環(huán)境惡化、過度捕撈(提取鱟試劑是捕撈鱟的主要目的之一)等原因，使我國鱟資源銳減，因而對鱟資源的保護迫在眉睫[16]。本實驗所采用的HL-60細胞系人源細胞，不再使用鱟、家兔等動物，消除了種屬差異，可作為熱原物質(zhì)檢查方法的有力補充。HL-60-IL-6單核細胞激活實驗對凍干人用狂犬病疫苗樣品的檢測結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以對熱原進行定量檢測。且根據(jù)文獻報道，該法不僅用于LPS檢測，還可用于革蘭氏陽性菌脂磷壁酸，真菌酵母多糖類熱原物質(zhì)的檢測，具有廣譜檢測多種熱原的能力，亦可避免使用人血或單核細胞所產(chǎn)生的倫理問題，從而更好地保障凍干人用狂犬病疫苗的臨床用藥安全，盡可能減少因熱原污染導(dǎo)致的不良反應(yīng)。

3.2 方法協(xié)作標(biāo)定的研究一個方法的研究從實驗室內(nèi)建立、實驗室內(nèi)驗證開始，到實驗室間轉(zhuǎn)移和再驗證完成，經(jīng)由多個實驗室不同人員對方法進行研究。對于方法協(xié)作標(biāo)定實驗室在接收到方法時，涉及的再驗證項目、實驗過程中考核指標(biāo)的實驗次數(shù)、符合要求評判標(biāo)準(zhǔn)等具體問題，我國尚無明確規(guī)定。大多數(shù)方法協(xié)作標(biāo)定的實驗室均基于2015年版《中國藥典》四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則進行了方法的再次驗證或部分驗證[17]。國家藥典委員會進行了關(guān)于《中國藥典》2020年版四部通則增修訂內(nèi)容(第十九批)的公示，在《分析方法轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則》公示稿中規(guī)定：“對分析方法轉(zhuǎn)移的可接受方法還包括再驗證或部分驗證。再驗證時，應(yīng)對通則9101《分析方法驗證指導(dǎo)原則》中收載的可能在轉(zhuǎn)移中受到影響的驗證指標(biāo)進行說明”。有望在《中國藥典》2020年版四部通則中增加《分析方法轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則》，為相關(guān)的方法協(xié)作標(biāo)定研究提供了理論指導(dǎo)和支持。