周金蓉 姚麗霞 蘇遠
非小細胞肺癌在肺癌整體發(fā)病率中占85%,癌細胞擴散速度較慢,但患者早期發(fā)病缺乏典型性癥狀,大多患者確診時已是晚期,已錯過腫瘤最佳治療時期,導致患者生存期縮短[1]。盡管近年來臨床和實驗腫瘤學取得了一定進展,但非小細胞肺癌的5年生存率仍處于較低水平[2]。因此,探討非小細胞肺癌的分子機制,尋找與非小細胞肺癌病情進展程度有關的生物學分子標志物,對改善患者預后具有重要臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是小的內(nèi)源非編碼RNA,廣泛存在于生物體中,可與靶基因mRNA的3’UTR結合實現(xiàn)對靶基因的轉錄與調(diào)控,參與細胞分化、凋亡等生理過程,與腫瘤、炎性反應等病理過程有關[3,4]。相關研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-580-3p(microRNA-580-3p,miR-580-3p)可增強轉錄激活因子3的表達,在黑色素瘤中激活酪氨酸蛋白激酶2/轉錄激活因子3信號通路,進而促進黑色素瘤病情發(fā)展[5]。由此推測,非小細胞肺癌組織中miR-580-3p表達可能與非小細胞肺癌的病情進展有關?;诖?,本研究分析非小細胞肺癌組織中miR-580-3p表達及臨床意義。
1.1 一般資料 選取2020年5~12月于武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院就診的非小細胞肺癌患者50例,其中男31例,女19例;年齡45~79歲,平均年齡(61.27±5.36)歲;體重指數(shù)(BMI)17.37~26.84 kg/m2,平均(22.17±1.43)kg/m2;病理類型:腺癌32例,鱗癌16例,腺鱗癌2例。患者已閱讀理解并簽署知情同意書。
1.2 納入與排除標準
1.2.1 納入標準:①臨床病理組織學確診為非小細胞肺癌;②TNM分期為Ⅰ~Ⅲ期;③認知功能正常,可配合完成研究。
1.2.2 排除標準:①合并肝癌、胃癌、食管癌等其他惡性腫瘤疾??;②既往接受過抗腫瘤治療;③伴自身免疫系統(tǒng)疾?。虎車乐匦母喂δ懿蝗?;⑤合并支氣管哮喘、肺結核等其他肺部疾?。虎藜韧芯癫∈?;⑦腫瘤已發(fā)生遠處轉移。
1.3 方法
1.3.2 miR-580-3p檢測方法:分別采非小細胞肺癌患者癌組織和癌旁組織,利用TRIZOL試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)提取組織樣本中的 RNA,嚴格參照逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)說明書,依據(jù)20 μl的反應體系進行逆轉錄,合成cDNA,試劑盒。利用實時熒光定量PCR儀(杭州安杰思生物科技有限公司,型號:AGS9600)進行實驗,將miR-580-3p、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge
nase,GAPDH)cDNA 實時熒光定量PCR反應體系設置為10 μl ,反應條件設置為:95℃時預變性30 s,95℃時變性5 s,60℃時退火30s,40個循環(huán),重復進行實驗3次。將GADPH作為內(nèi)參基因,并應用2-△△Ct法計算miR-580-3p 的相對表達量。見表1。
表1 引物序列信息
1.3.3 資料收集:性別(男、女)、年齡(<60歲、≥60歲)、體重指數(shù)(<28 kg/m2、≥28 kg/m2)、吸煙史(有、無,吸煙指數(shù)≥400,吸煙指數(shù)=每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、腫瘤直徑(≤3 cm、>3 cm)、病理類型(腺癌、鱗癌、腺鱗癌)、TNM分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)、淋巴結轉移(有、無)。
2.1 非小細胞肺癌組織與癌旁組織中miR-580-3p的表達比較 50例非小細胞肺癌患者中,腺癌32例,鱗癌16例,腺鱗癌2例。腺癌、鱗癌、腺鱗癌癌組織中miR-580-3p相對表達量均高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 非小細胞肺癌組織與癌旁組織中miR-580-3p的表達比較
2.2 非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與不同患者臨床資料的關系 TNM分期為Ⅲ期的非小細胞肺癌患者miR-580-3p表達水平依次低于TNM分期為Ⅱ、Ⅰ期的患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);性別、年齡、BMI、吸煙史、腫瘤直徑、病理類型、淋巴結轉移等與非小細胞肺癌組織中miR-580-3p表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。
表3 非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與不同患者臨床資料的關系
2.3 非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與TNM分期的相關性分析 Kendall’s tau-b相關性分析發(fā)現(xiàn),非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與TNM分期呈正相關(r=0.362,P=0.001)。
2.4 非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與TNM分期的關系Logistic回歸分析 將非小細胞肺癌患者TNM分期作為因變量(1=Ⅰ期,2=Ⅱ期,3=Ⅲ期),將癌組織中miR-580-3p的表達作為自變量,建立多項Logistic回歸模型,以Ⅰ期作為參照,檢驗非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與非小細胞肺癌患者TNM分期為Ⅱ期、Ⅲ期的關系,結果顯示,非小細胞肺癌組織中miR-580-3p高表達是TNM分期為Ⅱ期、Ⅲ期的危險因子(OR值分別為85.335、515.636,P值分別為0.043、0.001)。見表4。
表4 非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與TNM分期的關系Logistic回歸分析
遺傳、自身營養(yǎng)狀況以及環(huán)境等因素均可誘發(fā)非小細胞肺癌,可引起患者胸痛、咳血、發(fā)熱,若不及時治療,病情不斷向嚴重方向進展,嚴重影響患者的生存期[6]。手術、放化療、分子靶向治療為目前臨床治療非小細胞肺癌的重要治療手段,已取得較大進展,但部分晚期患者治療后預后仍舊較差,5年生存率較低[7]。研究指出,非小細胞肺癌患者的預后與腫瘤分期和治療效果有關,患者治療方案的選擇需依據(jù)腫瘤分期[8]。因此,尋找與非小細胞肺癌患者病情發(fā)展程度相關的指標,有助于臨床制定合理的治療措施,改善患者預后。
非小細胞肺癌的發(fā)展是一個多基因、多階段的緩慢過程,涉及廣泛的分子生物學變化[9]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼、長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,在細胞生長、發(fā)育、疾病發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用[10]。miRNA在多種惡性腫瘤組織中異常表達,參與notch、mTOR等多條信號通路的轉導,影響腫瘤細胞增殖、轉移等生物學行為,且miRNA不易被降解,可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[11,12]。目前臨床在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)多種miRNA異常表達情況,如miR-580、miR-580-3p等[13]。研究指出,miR-580在乳腺癌中,能夠直接與TWIST1的3’UTR結合,進而抑制腫瘤細胞的遷移[14]。而Li等[15]研究結果顯示,miR-580與黑色素瘤的發(fā)病機制和發(fā)展呈正相關。盡管miR-580的作用已被報道,但目前對miR-580-3p功能的了解十分有限,miR-580-3p為近些年發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關miRNA之一,參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。由此推測,非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達可能與病情進展有關。本研究中,腺癌、鱗癌、腺鱗癌癌組織中miR-580-3p相對表達量均高于癌旁組織,說明miR-580-3p可能參與了非小細胞肺癌的進展,與Ma等[16]研究結果一致。這可能因為miR-580-3p通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,增強腫瘤細胞的增殖能力,參與非小細胞肺癌進展[17]。而徐玉紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中miR-580-3p表達低于癌旁組織,這可能與卵巢癌A2780細胞系中ST7-AS1對miR-580-3p的負性把控有關。
Kendall’s tau-b相關性分析顯示,非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達與TNM分期有關,分析原因在于,miR-580-3p可與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域結合,長鏈非編碼RNA催化組蛋白賴氨酸三甲基化,調(diào)節(jié)組蛋白甲基化酶會導致組蛋白甲基化水平升高,導致靶基因miRNA轉錄后沉默,進而激活下游第十號染色體同源丟失性磷酸酶基因/白激酶信號通路,促進腫瘤細胞的增殖、轉移,促使患者病情不斷進展,因而TNM分期較高[19]。因此,檢測非小細胞肺癌組織中miR-580-3p的表達有助于評估患者病情程度。
Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),非小細胞肺癌組織中miR-580-3p高表達可促進患者病情進展,TNM分期較高。因此,建議臨床未來在對非小細胞肺癌患者入院時可盡早測定癌組織中miR-580-3p的相對表達量以反映患者病情進展程度,若miR-580-3p異常高表達,可積極調(diào)整治療方案,以控制患者疾病進展。本研究具有一定的局限性,觀察miR-580-3p在非小細胞肺癌組織中的表達時,未設置獨立的陰性樣本作為對照組進行比較,且本研究獲取的組織樣本,未對血液樣本miR-580-3p表達進行研究,未來還需做進一步探究,既設置獨立對照組進行觀察,并采集血液樣本,觀察非小細胞肺癌患者血液中miR-580-3p表達情況。
綜上所述,miR-580-3p在非小細胞肺癌組織中呈高表達,其高表達與非小細胞肺癌患者TNM分期有關,有希望成為后期深入研究治療非小細胞肺癌的新靶點。