盧迪 黎瑤 梅希 邱平

糖尿病(DM)是一種常見的代謝性疾病，常伴有慢性腎臟損害、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，超過1/3的DM患者將發(fā)展為糖尿病腎病(DN)，已成為終末期腎病的主要病因[1]。腎小管損傷是DN的重要特征，研究顯示高血糖刺激可誘導(dǎo)活性氧過量產(chǎn)生，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多；腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子可直接破壞腎結(jié)構(gòu)，加劇腎小管損傷[2]。因此，抑制腎小管上皮細(xì)胞損傷可能是阻斷DN進(jìn)展的有效策略。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA(circRNA)，其通過吸附特定微小RNA(miRNA)發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA作用廣泛參與細(xì)胞過程。許多研究報(bào)道circRNA靶向miRNA參與包括DN等DM并發(fā)癥的進(jìn)展[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在膿毒癥、骨關(guān)節(jié)炎等炎癥相關(guān)疾病中顯著升高，抑制其表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷、白介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[5,6]。靶基因預(yù)測(cè)到circATRNL1與miR-181a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。已有研究指出circATRNL1能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解[7]。因此，本研究探討circATRNL1靶向miR-181a-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡和炎性反應(yīng)的影響，為阻斷DN進(jìn)展提供潛在有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細(xì)胞(美國(guó)ATCC)；DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；青鏈霉素雙抗、胎牛血清(武漢普諾賽生物公司)；pcDNA、pcDNA-circATRNL1、anti-miR-NC、anti-miR-181a-5p、si-circATRNL1、si-NC、miR-NC、miR-181a-5p mimics(上海吉瑪制藥公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ABI公司)；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑盒(大連Takara生物技術(shù)公司)；SYBR Green PCR試劑盒(日本Toyobo公司)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、RIPA裂解緩沖液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物公司)；膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)(南京凱基生物科技公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(A01021)、剪切型半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved-caspase 9)兔多克隆抗體(ABP50009)、Cleaved-caspase3(IMG-5700)兔多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗(A21020)(武漢艾美捷科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：HK-2細(xì)胞接種含10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞90%融合時(shí)1∶3傳代。將對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板過夜，然后用Lipofectamine 2000將pcDNA(2 μg)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)、anti-miR-NC(20 nmol/L)、anti-miR-181a-5p(20 nmol/L)、si-NC(20 nmol/L)、si-circATRNL1(20 nmol/L)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)與miR-181a-5p mimics(20 nmol/L)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)與miR-NC(20 nmol/L)分別轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h測(cè)定轉(zhuǎn)染效果后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別用含5.5 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育未轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞24 h[8]，分別記為對(duì)照(Con)組、高糖(HG)組；用含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circATRNL1、anti-miR-NC、anti-miR-181a-5p、pcDNA-circATRNL1+ miR-181a-5p mimics、pcDNA-circATRNL1+ miR-NC的HK-2細(xì)胞24 h，分別記為HG+ pcDNA組、HG+ pcDNA-circATRNL1組、HG+ anti-miR-NC組、HG+anti-miR-181a-5p組、HG+ pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p組、HG+ pcDNA-circATRNL1+miR-NC組。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circATRNL1、si-NC、si-circATRNL1的HK-2細(xì)胞分別記為pcDNA組、pcDNA-circATRNL1組、si-NC組、si-circATRNL1組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)circATRNL1和miR-181a-5p表達(dá)：用TRIzol試劑從各組HK-2細(xì)胞提取總RNA、miRNA和circRNA分別用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green PCR試劑盒對(duì)miRNA和mRNA進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算circATRNL1(內(nèi)參為GAPDH)和miR-181a-5p(內(nèi)參為U6)相對(duì)表達(dá)量。circATRNL1上游引物5’-ACTGGTTTCAACATTT TCTATTCAA-3’；circATRNL1下游引物5’-GCTTCACCCTTCCAGTATTT-3’；GAPDH上游引物5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGTT-3’；GAPDH下游引物5’-TTGATTTTGGAGGGATCT CG-3’；miR-181a-5p上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCGG-3’；miR-181a-5p下游引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCGA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTGGGCAGCACA-3’；U6下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6水平：細(xì)胞處理完畢后，收集上清液，2 000 r/min離心20 min。參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率：用胰蛋白酶消化HK-2細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌后，用500 μl的1×結(jié)合緩沖液(含5 μl的annexin V-FITC和5 μl的碘化丙啶)重懸1×105個(gè)細(xì)胞，室溫避光孵育20 min。流式細(xì)胞儀和FlowJo 8.7.1軟件分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)：用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，定量后，取適量蛋白樣品在SDS/PAGE凝膠上分離并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，然后在室溫下將膜置于5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h。隨后將膜置于一抗溶液中4℃孵育過夜。次日，將膜與酶標(biāo)二抗在室溫下孵育1 h。滴加ECL試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。Quantity One 3.0軟件測(cè)定蛋白條帶的相對(duì)灰度值，GAPDH為內(nèi)參。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)：將含有miR-181a-5p結(jié)合位點(diǎn)對(duì)的circATRNL1野生型(WT)或突變型(MUT)序列分別克隆到pGL3載體，分別構(gòu)建重組載體WT-circATRNL1、MUT-circATRNL1。用Lipo 2000將miR-181a-5p mimics或miR-NC分別與WT-circATRNL1或MUT-circATRNL1共轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞。48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒評(píng)估熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性表示相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 circATRNL1和miR-181a-5p在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組比較，HG組HK-2細(xì)胞中circATRNL1相對(duì)水平顯著降低(P<0.05)，miR-181a-5p相對(duì)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 circATRNL1和miR-181a-5p在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2 circATRNL1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的影響 HG組HK-2細(xì)胞中circATRNL1相對(duì)水平較Con組顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.05)。與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-circATRNL1組HK-2細(xì)胞中circATRNL1相對(duì)水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 circATRNL1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響;A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表2 circATRNL1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的影響

2.3 circATRNL1靶向調(diào)控miR-181a-5p的表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)到circATRNL1與miR-181a-5p存在互補(bǔ)核苷酸序列。與miR-NC+WT-circATRNL1組比較，miR-181a-5p+WT-circATRNL1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC+MUT-circATRNL1組比較，miR-181a-5p+ MUT-circATRNL1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pcDNA-circATRNL1組HK-2細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平顯著低于pcDNA組(P<0.05)；si-circATRNL1組HK-2細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平顯著高于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4，圖2。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 circATRNL1調(diào)控miR-181a-5p表達(dá)

圖2 circATRNL1的序列中含有與miR-181a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.4 干擾miR-181a-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響 與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-181a-5p組HK-2細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 干擾miR-181a-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響

2.5 上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circATRNL1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的作用 與HG+pcDNA

-circATRNL1+miR-NC組比較，HG+pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p組HK-2細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circATRNL1過表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用

3 討論

越來越多的研究表明circRNA在DN的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。Wang等[9]報(bào)道circ_0037128在DN模型和高糖處理的系膜細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，且敲減circ_0037128可抑制系膜細(xì)胞增殖和纖維化。Yao等[10]觀察到circ_0000285通過靶向miR-654-3p激活絲裂原活化蛋白激酶6可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎性反應(yīng)。An等[11]發(fā)現(xiàn)干擾circ_0003928表達(dá)通過上調(diào)miR-151-3p抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞circATRNL1表達(dá)顯著下調(diào)，提示circATRNL1可能在DN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。功能分析顯示，過表達(dá)circATRNL1可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡以及炎性因子TNF-α、IL-6的釋放。caspase9和caspase3分別是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子和效應(yīng)因子，研究報(bào)道高糖刺激可激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)caspase9和caspase3活化，促進(jìn)HK-2細(xì)胞凋亡[12,13]。本研究中過表達(dá)circATRNL1顯著抑制高糖誘導(dǎo)的Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)上調(diào)，表明circATRNL1通過抑制caspase依賴凋亡途徑抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。因此，circATRNL1對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這與circATRNL1在骨關(guān)節(jié)炎中的抗炎、抗凋亡作用[7]一致。

miR-199a-3p在各種疾病中調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。研究顯示鏈脲霉素誘導(dǎo)大鼠胰島素瘤細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-199a-3p可抑制鏈脲霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[14]。miR-199a-3p還作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA小核RNA宿主基因1(SNHG1)的下游靶點(diǎn)介導(dǎo)敲低SNHG1對(duì)帕金森病模型細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[15]。然而，miR-199a-3p在急性腦缺血患者、大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型小鼠、糖氧剝奪復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可減少M(fèi)CAO小鼠腦梗死面積、損傷神經(jīng)元數(shù)量，并減少糖氧剝奪復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]，還可改善高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[17]，這可能與miR-199a-3p在不同細(xì)胞中通過不同機(jī)制調(diào)控凋亡和炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞miR-199a-3p表達(dá)顯著上調(diào)，抑制其表達(dá)可抑制caspase9和caspase-3激活，抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎性因子釋放，由于雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-199a-3p是circATRNL1的直接靶點(diǎn)，RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)circATRNL1對(duì)miR-199a-3p具有靶向負(fù)性調(diào)控作用，且過表達(dá)circATRNL1和抑制miR-199a-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2損傷的保護(hù)作用類似，提示可能存在circATRNL1/miR-199a-3p途徑。深入研究顯示，過表達(dá)miR-199a-3p可減弱過表達(dá)circATRNL1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2損傷的保護(hù)作用，這進(jìn)一步證實(shí)circATRNL1至少通過靶向miR-199a-3p調(diào)控DN進(jìn)展。

綜上所述，circATRNL1通過抑制細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)可減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制與靶向下調(diào)miR-199a-3p表達(dá)有關(guān)，circATRNL1和miR-199a-3p是DN的潛在有效治療靶點(diǎn)。