李威 王婷 張紅蕾

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。目前，胃癌主要采用手術(shù)聯(lián)合放療、化療和靶向治療等現(xiàn)代治療策略，但仍存在療效低、毒性大、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等缺點。因此，研究胃癌進展的機制，確定有效的藥物或治療靶點具有重要意義。鳳尾草總黃酮是從鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬植物Pteris multifida Poir中提取的有效活性成分，近年研究表明鳳尾草總黃酮對多種癌癥具有顯著的抗腫瘤活性[2]。如鳳尾草總黃酮可抑制宮頸癌細胞增殖和腫瘤形成，抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲[2,3]。然而，鳳尾草總黃酮在胃癌中的抗癌功能未見報道。微小RNA(miRNA)是單鏈、內(nèi)源性RNA轉(zhuǎn)錄本，其通過與靶向mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制，參與多項細胞活動[4]。目前，多種miRNA已被證實在胃癌中表達失調(diào)，參與胃癌發(fā)生和進展[5]。miR-1274a在胃癌中表達上調(diào)，并直接靶向叉頭轉(zhuǎn)錄因子4(FOXO4)加速胃癌細胞增殖和遷移[6]。前期預(yù)實驗顯示鳳尾草總黃酮能夠下調(diào)胃癌細胞中miR-1274a表達水平。因此，本研究假設(shè)鳳尾草總黃酮通過下調(diào)miR-1274a在胃癌中發(fā)揮抗癌作用，并通過體外實驗進行驗證，為開發(fā)鳳尾草總黃酮為新型抗胃癌藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌細胞AGS、Ham’s F-12培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于武漢普諾賽生命科學(xué)公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miRNA模擬物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)購自廣州銳博生物公司；鳳尾草由我院中藥房提供；Transwell板(24孔)購自美國Corning公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)兔源多克隆抗體(AF0234)、MMP-9兔源多克隆抗體(AF5234)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔源單克隆抗體(AF1186)、TRIzol試劑購自上海碧云天生物研究所；Mir-X miRNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II購自大連Takara生物公司。

1.2 方法

1.2.1 鳳尾草總黃酮制備[3]:將200 g鳳尾草粉碎，按照料液比1∶120加入70%乙醇溶液，60℃條件下提取2次，2 h/次。合并提取液，經(jīng)凍干得固體4.0 g，溶解于400 ml磷酸鹽緩沖液中，15 000 r/min速度離心15 min，離心3次，收集上清液，0.22 mm濾膜過濾除菌后保存于4℃冰箱。以蘆丁為對照測定總黃酮含量，溶液配制成總黃酮含量為10 mg/ml保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng):AGS細胞接種含有Ham’s F-12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗)的培養(yǎng)皿中置于含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中細胞鋪板率約80%時胰酶消化1∶3傳代，換液頻率為2～3次/周。選擇第5代對數(shù)期AGS進行實驗。

1.2.3 實驗分組:將AGS細胞以1×105個/孔的密度接種24孔板，當(dāng)細胞鋪板率約50%時分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-1274a、miR-1274a mimics、miR-NC至AGS細胞中，具體步驟參照Lipofectamine 2000說明書。轉(zhuǎn)染48 h收獲AGS細胞，RT-qPCR檢測miR-1274a的相對水平驗證轉(zhuǎn)染效果。用含0、5、10、20 g/L鳳尾草總黃酮[3]的培養(yǎng)液孵育AGS細胞，記為對照組、鳳尾草總黃酮-低組、鳳尾草總黃酮-中組、鳳尾草總黃酮-高組。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的AGS細胞記為anti-miR-NC組；轉(zhuǎn)染anti-miR-1274a的AGS細胞記為anti-miR-1274a組；用含20 g/L鳳尾草總黃酮的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染miR-1274a mimics、轉(zhuǎn)染miR-NC的AGS細胞，分別記為鳳尾草總黃酮+miR-NC組、鳳尾草總黃酮+miR-1274a組。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖:將未轉(zhuǎn)染AGS細胞，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-1274a、miR-1274a mimics、miR-NC的AGS均以5×103個/孔密度接種96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。按照實驗分組用含對應(yīng)濃度鳳尾草總黃酮的培養(yǎng)液孵育細胞48 h。更換為新鮮培養(yǎng)液，加入MTT溶液(20 μl)孵育4 h，加入二甲基亞砜(150 μl)反應(yīng)15 min，低速振蕩溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀在490 nm測量吸光度(A)。抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 平板克隆實驗檢測克隆形成:胰酶消化各組AGS細胞，用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞。每組取300個AGS細胞接種6孔板，轉(zhuǎn)動平板使細胞均勻分散。每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育12～14 d，當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細胞克隆，0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下拍照，計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移:每組取1×104個AGS細胞接種6孔板，放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞鋪板6孔板底。每組設(shè)置3個復(fù)孔。用200 μl移液吸頭尖端垂直6孔板直接劃傷單層細胞。洗去細胞碎片，加入無血清培養(yǎng)基置，放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在初始培養(yǎng)時和培養(yǎng)24 h時用顯微鏡拍照，ImageJ測量初始劃痕距離和24 h劃痕距離。劃痕愈合率(%)=(初始劃痕距離-24 h劃痕距離)/初始劃痕距離×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲：將各組AGS細胞重懸在無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。向包被基質(zhì)膠的Transwell裝置上室加入200 μl 細胞懸液，向下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個平行。放入含95%空氣、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell裝置，擦去上室基質(zhì)膠和殘留的細胞。4%多聚甲醛固定侵襲細胞，0.1%結(jié)晶紫染色。將Transwell小室倒置在在顯微鏡下拍照，隨機選擇5個視野計數(shù)，用平均值表示AGS細胞侵襲數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白質(zhì)印記法檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達:RIPA裂解液提取AGS細胞總蛋白。定量后，設(shè)置電壓100 V，時間90 min進行SDS-PAGE。每組設(shè)置3個平行。設(shè)置電流300 mA、電流30 min進行濕法轉(zhuǎn)膜。取出硝酸纖維素(NC)膜，放入含5%脫脂奶粉的孵育盒中封閉2 h。取出NC膜，放入一抗稀釋液中室溫孵育2 h。取出NC膜，放入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫反應(yīng)1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯色。Image J軟件測定條帶灰度值，將GAPDH作為參照，對MMP-2和MMP-9蛋白表達進行半定量分析。MMP-2抗體按照體積比1∶1 000稀釋，MMP9抗體和二抗按照體積比1∶1 500稀釋，GAPDH抗體按照體積比1∶2 000稀釋。實驗重復(fù)3次。

1.2.9 RT-qPCR檢測miR-1274a表達:使用TRIzol試劑從各組AGS細胞中提取RNA，NanoDrop 1000分光光度計法評估提取RNA的濃度和質(zhì)量(A260/A280值1.8～2.0為合格)。Mir-X miRNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，然后采用SYBR Premix Ex Taq II進行RT-qPCR檢測miR-1274a表達。每組設(shè)置3個平行。將U6作為參照，2-ΔΔCt方法計算miR-1274a的相對水平。miR-1274a上游引物5’-GCCGAGTTCAGGTCCCT

GTT-3’，miR-1274a下游引物5’-CTCAACTGGTGTCG

TG GA-3’；U6上游引物5’-GCGCGTCGTGAAGCGTT

C-3’，U6下游引物5’-GTGCAGGGTC CG AGGT-3’。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞增殖的影響 與對照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞增殖的影響

2.2 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

表2 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞遷移侵襲的影響

2.3 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞miR-1274a表達的影響 與對照組比較，鳳尾草總黃酮(低、中、高)組AGS細胞miR-1274a相對水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞miR-1274a表達的影響

2.4 干擾miR-1274a表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 anti-miR-1274a組AGS細胞中miR-1274a相對水平低于anti-miR-NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染anti-miR-1274a可抑制miR-1274a表達。與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1274a組AGS細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 干擾miR-1274a表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 干擾miR-1274a表達對胃癌AGS細胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 過表達miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮(20 g/L)對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與鳳尾草總黃酮+miR-NC組比較，鳳尾草總黃酮+miR-1274a組AGS細胞miR-1274a相對水平、克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)以及MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 過表達miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的作用

表5 過表達miR-1274a逆轉(zhuǎn)了鳳尾草總黃酮對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

中藥天然產(chǎn)物具有生物活性廣泛、低毒、價格低廉等優(yōu)點，已成為新型抗腫瘤藥物開發(fā)的巨大寶庫[7]。已有的研究表明鳳尾草總黃酮在多種癌癥中具有抗癌活性，如鳳尾草總黃酮可以改善荷瘤小鼠免疫功能，增強其抗氧化能力，抑制小鼠移植瘤H22的生長[8]。鳳尾草總黃酮可以降低肺癌和腦膠質(zhì)瘤細胞遷移能力[9,10]。本研究評估了鳳尾草總黃酮對胃癌細胞的體外抗腫瘤作用。

本研究中，MTT和克隆形成實驗結(jié)果表明，鳳尾草總黃酮明顯抑制胃癌細胞AGS增殖能力；劃痕愈合實驗和Transwell實驗表明，鳳尾草總黃酮還可降低AGS遷移和侵襲能力；此外，實驗數(shù)據(jù)提示，鳳尾草總黃酮對AGS細胞的抗增殖、抗遷移和抗侵襲功能具有顯著的劑量依賴關(guān)系。國外的一項研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)、多步驟的過程，其中MMPs可降解細胞外機制中膠原、明膠、纖連蛋白等多種成分，在癌癥轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[11]。既往研究表明胃癌組織中MMP-2和MMP-9的高表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤密切相關(guān)，下調(diào)MMP-2和MMP-9表達可降低胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力[12]。本研究結(jié)果表明，鳳尾草總黃酮以劑量依賴方式降低MMP-2和MMP-9表達，這進一步證實鳳尾草總黃酮對胃癌細胞的遷移和侵襲抑制作用。因此，鳳尾草總黃酮有可能成為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的化療抑制劑。

miRNA失調(diào)在胃癌等許多類型癌癥中起著至關(guān)重要的作用，其差異表達能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞生物學(xué)行為。研究顯示，前列腺癌、結(jié)腸癌中miR-1274a表達上調(diào)，miR-1274a高表達與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤和TNM分期相關(guān)相關(guān)，并預(yù)示結(jié)腸癌患者總體生存期較差，抑制miR-1274a表達可降低結(jié)腸癌細胞的惡性潛能[13,14]。在透明腎細胞癌中抑制miR-1274a表達顯著抑制癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。然而，miR-1274a在骨肉瘤miR-1274a表達降低，并促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，這種差異可能與miR-1274a的組織特異表達模式相關(guān)[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，鳳尾草總黃酮顯著降低AGS細胞中miR-1274a表達水平，提示鳳尾草總黃酮可能通過調(diào)控miR-1274a發(fā)揮抗胃癌作用。體外功能驗證表明，抑制miR-1274a表達顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9表達，降低AGS細胞增殖、遷移和侵襲能力，與鳳尾草總黃酮的抗胃癌作用類似?；貜?fù)實驗顯示，過表達miR-1274a能夠減弱鳳尾草總黃酮對AGS細胞惡性行為的抑制作用，這進一步證實鳳尾草總黃酮至少通過下調(diào)miR-1274a在胃癌中發(fā)揮抗癌作用。然而，miR-1274a的下游靶點需要在未來的研究中進一步闡明和證實。

綜上所述，鳳尾草總黃酮對胃癌細胞具有抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用，其機制與下調(diào)miR-1274a表達有關(guān)，表明鳳尾草總黃酮在胃癌治療中具有潛在的應(yīng)用價值。