張婧旭，梁海英，曾智勇，湯德元，王 彬，徐松平，徐 玉，祝 羊，萬 娟，柳佳佳，邊孟婷，黃 書

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

輪狀病毒?。╮otavirus disease）是由輪狀病毒（rotavirus，RV）感染幼齡動(dòng)物和嬰幼兒引起的一種急性胃腸道傳染病，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康都有較大危害[1-2]。豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬，基因組由11 個(gè)雙鏈RNA 節(jié)段組成，全長18.2 kb 左右，編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1—VP4、VP6、VP7）和6 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1—NSP6）[3-5]。豬主要易感A、B、C、D、E、F 6 個(gè)血清群，其中A 群為典型RV，引發(fā)89%以上豬RV 感染腹瀉[6]。VP7蛋白屬于外衣殼蛋白的型特異性抗原，包含能夠逃脫各種單克隆抗體中和作用的突變位點(diǎn)，具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的功能，可影響機(jī)體的免疫效應(yīng)，是目前疫苗研究中常用的靶抗原[7-8]。

近年來，PoRV 感染發(fā)病情況整體呈上升趨勢，加之病毒本身的分節(jié)段特征，不同來源的病毒感染同一細(xì)胞后，容易出現(xiàn)重配，尤其是同一血清型病毒之間可能發(fā)生基因交換和重組，導(dǎo)致新病毒出現(xiàn)[7-9]。本病的防控方式主要為疫苗接種，因此研制高效優(yōu)質(zhì)的疫苗至關(guān)重要。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，可揭示病毒的致病機(jī)理，為疫苗研究奠定基礎(chǔ)[10-11]。本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)臨床分離株（GZAS2020）與疫苗株（NX）VP7 蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能和B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了比較分析，以期為候選疫苗株篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株序列

PoRV GZAS2020 株和NX 疫苗株序列，由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室序列庫保存。兩株毒株VP7基因開放閱讀框大小均為981 bp，編碼326 個(gè)氨基酸（aa）。

GZAS2020 株VP7基因開放閱讀框推導(dǎo)氨基酸序列：MYGIEYTTVLTFLISLVFVNYILKSVTRTMDFIIYRFLLVIVALAPFIKTQNYGINLPITGSMDTPYANSTTSETFLTSTLCLYYPNEAATEIADAKWTETLSQLFLTKGWPTGSVYFKGYADIASFSVEPQLYCDYNIVLMKYDGNLQLDMSELADLILNEWLCNPMDITLYYYQQTDEANKWISMGTSCTIKVCPLNTQTLGIGCTTTDINSFEMVANAEKLAITDVVDGVNHKLDVTTNTCTIRNCKKLGPRENVAVIHVGGPNILDITADPTTAPQTERMMRINWKRWWQVFYTIVDYVNQIVQVMSKRSRSLDSAAFYYRV。

NX 株VP7基因開放閱讀框推導(dǎo)氨基酸序列：MYGIEYTTVLTFLISIILLNYILKSLTSAMDFIIYRFLLLIVIVSPFVKTQNYGINLPITGSMDTAYANSSQQETFLTSTLCLYYPTEASTQIGDTKWKDTLSQLFLTKGWPTGSVYFKEYTDIASFSIDPQLYCDYNVVLMKYDSTLELDMSELADLILNEWLCNPMDITLYYYQQTDEANKWISMGQSCTIKVCPLNTQTLGIGCTTTNAATFEEVATGEKLVITDAVDGVNHKLDVTTNTCTIRNCKKLGPRENVAIIQIGGSEVLDITADPTTTPQTERMMRVNWKKWWQVFYTVVDYINQIVQVMSKRSRSLNSATFYYRV。

1.2 方法

1.2.1 理化性質(zhì)分析 利用在線網(wǎng)站Expasy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析VP7 蛋白的基本理化性質(zhì)，Expasy ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析VP7蛋白的親疏水性。

1.2.2 糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析 利用在線網(wǎng)站YinOYang-1.2（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?YinOYang-1.2）、NetNGlyc-1.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）、NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分別分析VP7 蛋白的O 糖基化、N 糖基化和磷酸化位點(diǎn)。

1.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測 利用在線網(wǎng)站TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）和SignaIP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）分別預(yù)測VP7 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。

1.2.4 亞細(xì)胞定位分析 利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)VP7 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.2.5 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線網(wǎng)站SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測VP7 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）同源建模預(yù)測VP7 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.6 B 細(xì)胞表位預(yù)測 利用在線網(wǎng)站ABCpred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）和IEDB（http://www.iedb.org/）預(yù)測VP7 蛋白的B 細(xì)胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白理化性質(zhì)和親疏水性分析結(jié)果（表1）顯示：兩種VP7 蛋白的穩(wěn)定系數(shù)分別為36.63 和33.55。根據(jù)Expasy-ProtParam 軟件規(guī)定，不穩(wěn)定系數(shù)大于40 為不穩(wěn)定蛋白，小于40 為穩(wěn)定蛋白，因此兩種VP7 蛋白均為穩(wěn)定蛋白。

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白在179 aa 處親水性最小值（MIN）均為-2.400，41 aa 處親水性最大值（MAX）分別為3.411 和3.422，GRAVY值（GRAVY 值在-2～2 的范圍內(nèi)屬于親水性蛋白）分別為0.5055 和0.511，因此兩種VP7 蛋白均屬于親水性蛋白。

2.2 糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白O 糖基化、N 糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：GZAS2020株VP7 蛋白含有55 個(gè)O 糖基化位點(diǎn)、1 個(gè)N 糖基化位點(diǎn)和29 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，NX 株VP7 蛋白含有62 個(gè)O 糖基化位點(diǎn)、1 個(gè)N 糖基化位點(diǎn)和30個(gè)磷酸化位點(diǎn)。GZAS2020 株與NX 株相比，有50 個(gè)相同的O 糖基化位點(diǎn)，但少7 個(gè)O 糖基化位點(diǎn)；GZAS2020 株 在29、72、73、99、189 aa 處存在5 個(gè)獨(dú)有O 糖基化位點(diǎn)，NX 株在28、45、87、90、96、122、146、147、220、266、321、278 aa 處存在12 個(gè)獨(dú)有O 糖基化位點(diǎn)；兩種蛋白的N 糖基化位點(diǎn)完全一致，均位于69 aa 位點(diǎn)處；GZAS2020 株含有29 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（14 個(gè)蘇氨酸、12 個(gè)絲氨酸、3 個(gè)酪氨酸），NX 株有30 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（14 個(gè)蘇氨酸、12 個(gè)絲氨酸、4 個(gè)酪氨酸）；GZAS2020 株 在15、73、128、214、314 aa 處 存在獨(dú)有的5 個(gè)絲氨酸，在50、65、71、72、189 aa處存在獨(dú)有的5 個(gè)蘇氨酸，GZAS2020 株與NX 株雖在71、214 aa 位點(diǎn)處均有磷酸化位點(diǎn)，但71 aa位點(diǎn)處GZAS2020 株為蘇氨酸，NX 株為絲氨酸，214 aa 位點(diǎn)處GZAS2020 株為絲氨酸，NX 株為蘇氨酸，GZAS2020 株有3 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)與NX株一致。

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果顯示：兩種VP7 蛋白均有2 個(gè)跨膜螺旋，為二次跨膜蛋白，其中4～23、32～54 aa 屬于跨膜區(qū)域，1～3、55～326 aa 屬于胞外區(qū)，24～31 aa 屬于胞內(nèi)區(qū)；兩種VP7 蛋白均不具有信號(hào)肽，均為非分泌性蛋白。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示：GZAS2020 株VP7 蛋白亞細(xì)胞定位的質(zhì)膜數(shù)為21、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為7、細(xì)胞外基質(zhì)為3、溶酶體為1；NX 株質(zhì)膜數(shù)為24、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為7、細(xì)胞外基質(zhì)為1。基于亞細(xì)胞定位預(yù)測的最高數(shù)值即為定位位置，因此兩種VP7 蛋白均定位于質(zhì)膜。

2.5 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：兩種VP7 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋（Alpha helix，Hh）、延伸（Extended strand，Be）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，Tt）和無規(guī)則卷曲（Random coil，Cc）。其中：GZAS2020 株有α-螺旋128 個(gè)、延伸81 個(gè)、β-轉(zhuǎn)角10 個(gè)、無規(guī)則卷曲107 個(gè)，分別占39.26%、24.85%、3.07%和32.82%；NX 株有α-螺旋118 個(gè)、延伸86 個(gè)、β-轉(zhuǎn)角12 個(gè)、無規(guī)則卷曲110 個(gè)，分別占36.20%、26.38%、3.68%和33.74%。

GZAS2020 株和NX 株VP7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源構(gòu)建結(jié)果（圖1）顯示，兩種蛋白均以6wxe.1.1 為模板，相似性分別為85.58% 和88.65%，覆蓋值均為1.0，GMQE 值分別為0.74 和0.71，QMEANDisCo Global 得分分別為0.75±0.05和0.72±0.05。

2.6 B 細(xì)胞表位預(yù)測

ABCpred 預(yù)測的B 細(xì)胞表位通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)得分進(jìn)行排序，以0.5 為閾值，得分越高代表作為表位的可能性越高。GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白的B 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果（表2）顯示：以0.5 為閾值，GZAS2020 株有35 條序列，NX 株有31 條序列。分別選擇得分較高的前9 條序列，結(jié)合IEDB 在線軟件分析結(jié)果，從線性抗原表位、β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、柔韌性、抗原性和親水性6 個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測，篩選最優(yōu)抗原表位。

表2 ABCPred B 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

柔韌性值越大，代表柔韌性越強(qiáng)，越有利于與抗體結(jié)合。GZAS2020 株（圖2）柔韌性分析參數(shù)以0.984 為基線，篩選出的B 細(xì)胞抗原表位為67～72 aa（PYANSTT）、97～100 aa（KWTE）、176～179 aa（QQTD）、276～283 aa（TTAPQTER），NX 株（圖3）柔韌性分析參數(shù)以0.989 為基線，篩選出的B 細(xì)胞抗原表位為96～99 aa（TKWK）、176～182 aa（QQTDEAN）、274～279 aa（DPTTTP）、310～317 aa（MSKRSRSL）。

圖2 GZAS2020 株VP7 蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

圖3 NX 株VP7 蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

3 討論

VP7 蛋白具有誘導(dǎo)中和抗體的功能，含有能夠逃脫各種單克隆抗體中和作用的突變位點(diǎn)，是目前疫苗研究常選的靶抗原。對(duì)VP7 蛋白進(jìn)行研究，有助于篩選疫苗候選株。本研究利用Expasy-ProParam、YinOYang-1.2、TMHMM-2.0、ABCpred 和IEDB 等軟件，對(duì)PoRV GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能和B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測和分析。

有文獻(xiàn)[12]表明，N 糖基化位點(diǎn)與免疫原性和抗原性相關(guān)。GZAS2020 株和NX 株VP7 蛋白存在相同的N 糖基化位點(diǎn)，均位于69 位點(diǎn)處，提示該位點(diǎn)可能對(duì)免疫原性和抗原性具有重要意義；跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果顯示，兩種VP7 蛋白均屬于跨膜蛋白和非分泌性蛋白；亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，兩種VP7 蛋白均定位于質(zhì)膜，在質(zhì)膜中發(fā)揮功能；二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，兩種VP7 蛋白均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。α-螺旋結(jié)構(gòu)不易形成抗原表位，而無規(guī)則卷曲的柔軟結(jié)構(gòu)容易發(fā)生扭曲盤旋，常存在于蛋白表面，有利于與抗體結(jié)合，可能存在潛在的B 細(xì)胞抗原表位[13-14]。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與B 細(xì)胞表位密切相關(guān)，通過ABCpred 和IEDB 預(yù)測兩種VP7 蛋白的B 細(xì)胞表位，篩選出GZAS2020 株VP7 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位為67～72 aa（PYANSTT）、97～100 aa（KWTE）、176～179 aa（QQTD）、276～283 aa（TTAPQTER），NX 株的B 細(xì)胞抗原表位為96～99 aa（TKWK）、176～182 aa（QQTDEAN）、274～279 aa（DPTTTP）、310～317 aa（MSKRSRSL），兩者在97～100、176～179、276～279 aa 處存在相同的B 細(xì)胞抗原表位，但GZAS2020 株在無規(guī)則卷曲位置（67～72 aa）存在獨(dú)特的B 細(xì)胞抗原表位。無規(guī)則卷曲的柔軟結(jié)構(gòu)有利于與抗體結(jié)合，因此推測67～72 aa 具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可能存在潛在的B細(xì)胞抗原表位。另外，GZAS2020 株97～100 aa 的抗原表位位于VP7 蛋白的中和抗原7-1 區(qū)域[15]，與NX 株97～99 aa 的抗原表位存在差異，這可能是疫苗不能起到很好預(yù)防效果的原因。

本研究對(duì)PoRV 臨床分離株和疫苗株的VP7蛋白進(jìn)行了較為全面的生物信息學(xué)預(yù)測分析，為進(jìn)一步研究其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能，預(yù)測B 細(xì)胞抗原表位，篩選合適肽段，研制優(yōu)質(zhì)高效疫苗奠定了基礎(chǔ)。