徐長(zhǎng)亮，陳相宇，曹天亞，卞 軍，郝國(guó)輝

（1.宿遷市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇宿遷 223800；2.宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇宿遷 223800； 3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇南京 210036）

糧食在種植、收獲、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中易被真菌感染而產(chǎn)生真菌毒素，這些真菌毒素隨著糧食及其制品進(jìn)入食物鏈，最終可能引起人或動(dòng)物的致癌、致畸等病變。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名嘔吐毒素，對(duì)糧食污染最為普遍，且玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇容易動(dòng)態(tài)積累[1]。人和動(dòng)物食用嘔吐毒素超標(biāo)的食物后容易出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃部不適、免疫抑制以及生殖異常等癥狀[2]。因此，檢測(cè)糧食中的真菌毒素，能夠保障糧食食用安全。

嘔吐毒素的檢測(cè)技術(shù)有很多，如薄層色譜法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金免疫層析法[6]、時(shí)間分辨熒光免疫法以及化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。近年來(lái)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其檢測(cè)周期短、靈敏度好、準(zhǔn)確度高和重復(fù)性優(yōu)異而被廣泛應(yīng)用在多種真菌毒素檢測(cè)中。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，采用《糧油檢驗(yàn) 主要谷物中16種真菌毒素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》 （LS/T 6133—2018）[7]對(duì)小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)同位素內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法進(jìn)行定量比對(duì)，同時(shí)也對(duì)該方法中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法檢出限和方法定量限進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)溶液，購(gòu)自Dr公司；乙腈、甲醇、乙酸銨和乙酸，均為色譜純，購(gòu)自Merk公司；0.22 μm濾膜，購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters TQS 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；PL602E電子天平（梅特勒-托利多公司）；TG16-WS離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；振蕩器（Talboys公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取

正確稱取5.00 g小麥粉于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸混合液（體積比為70∶29∶1）對(duì)樣品進(jìn)行提取，渦旋振蕩提取30 min，然后離心 10 min（離心速度不低于6 000 r·min-1），吸取0.5 mL 上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL水并渦旋混勻，在4 ℃下離心10 min（離心速度不低于 12 000 r·min-1）），取上清液過(guò)0.2 μm聚四氟乙烯 濾膜，收集濾液。一份濾液直接上機(jī)測(cè)定，一份取180 μL濾液，并加入20 μL穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)后，渦旋混勻，供液相串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成兩份0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1、0.8 mg·L-1和1.0 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，一份直接上機(jī)測(cè)定，一份取180 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入20 μL穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)后，渦旋混勻，供液相串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素內(nèi)標(biāo)離子圖

2 結(jié)果及分析

2.1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其同位素離子圖

同位素是指原子序數(shù)（質(zhì)子數(shù)）相同而質(zhì)量數(shù)（中子數(shù)）不同的元素，可分為穩(wěn)定性同位素和放射性同位素。穩(wěn)定性同位素是天然存在的，目前技術(shù)手段檢測(cè)不到放射性的一類同位素。與放射性元素示蹤技術(shù)相比，穩(wěn)定性同位素技術(shù)無(wú)輻照傷害、安全、不受半衰期的影響，可適用于長(zhǎng)時(shí)間的示蹤實(shí)驗(yàn)。同位素內(nèi)標(biāo)法，應(yīng)該是目前最準(zhǔn)確的分析方法，因?yàn)樗麄兘Y(jié)構(gòu)一樣，唯一的區(qū)別是H被D（或者是C及其他原子）取代，推測(cè)其離子化效率，分離度等幾乎一樣。通過(guò)檢測(cè)得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素離子圖見圖1，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其同位素內(nèi)標(biāo)離子的保留時(shí)間基本一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以待測(cè)毒素及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)各個(gè)數(shù)值點(diǎn)進(jìn)行最小二乘線性擬合，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）同位素內(nèi)標(biāo)法擬合曲線，線性方程為Y=172.082X+2 015.03，相關(guān)系數(shù)為0.998 2。

以待測(cè)毒素濃度比為橫坐標(biāo)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）峰面積比為縱坐標(biāo)，對(duì)各個(gè)數(shù)值點(diǎn)進(jìn)行最小二乘線性擬合，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）外標(biāo)法擬合曲線，線性方程為Y=422.021X- 34 359.1，相關(guān)系數(shù)為0.993 0。

2.3 方法檢出限和定量限驗(yàn)證

按照LS/T 6133—S/T 方法，分別在樣品中加入方法檢出限和定量限濃度的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照提取過(guò)程進(jìn)行處理后得到結(jié)果。對(duì)添加濃度為45 μg·kg-1的樣品（濃度與方法檢出限一致）檢測(cè)，7次測(cè)量結(jié)果的平均回收率為87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.4%；對(duì)添加濃度為150 μg·kg-1樣品（濃度與方法定量限一致）檢測(cè)，7次測(cè)量結(jié)果的回收率為98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%。

依據(jù)《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417證指南行處）對(duì)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)評(píng)定，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室具備使用LS/T 6133—2018對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進(jìn)行檢測(cè)的能力。

2.4 小麥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外標(biāo)校正結(jié)果與內(nèi)標(biāo)校正結(jié)果分析

按照LS/T 6133—2018方法對(duì)國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉（GBW（E）100382）中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）進(jìn)行檢測(cè)，并分別使用內(nèi)標(biāo)法及外標(biāo)法擬合曲線進(jìn)行校正分析，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

依據(jù)《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》（GB/T 32465—2015）標(biāo)準(zhǔn)，使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)結(jié)果正確度進(jìn)行判定，小麥有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （GBW（E）100382）中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法校正結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的偏差為0.26，小于一倍標(biāo)準(zhǔn)值偏差（0.30 mg·kg-1），符合偏差要求，結(jié)果準(zhǔn)確；使用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行校正的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的偏差為1.37，大于3倍標(biāo)準(zhǔn)值偏差，不符合準(zhǔn)確度要求，結(jié)果不準(zhǔn)確。

表1 小麥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）結(jié)果分析

3 結(jié)論

按照《糧油檢驗(yàn) 主要谷物中16種真菌毒素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（LS/T 6133—2018）對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便快捷，提取步驟精簡(jiǎn)方便，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法得到的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度符合要求，是目前檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和其他真菌毒素比較有優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)方法。但目前市場(chǎng)上穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)購(gòu)買價(jià)格高昂，期待穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)商品化后的價(jià)格能夠有所降低。