錢坤，賀雪萍，王立業(yè)，韓俊領(lǐng)

協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司(天津 300384)

臍血造血干細(xì)胞(Hemopoieticstemcells，HSCs)有著自我更新和多向分化的生物學(xué)功能。臍血作為一種珍貴的生物資源，已成為異基因造血干細(xì)胞移植中一個重要的干細(xì)胞來源，被越來越廣泛地應(yīng)用于兒童及成人的惡性和非惡性血液病的治療[1]。世界范圍內(nèi)臍血庫凍存臍血超過600000份備用查詢[2]。臍血供體的選擇通常以HLA匹配和有核細(xì)胞總數(shù)(totalnucleatedcells，TNC)為主要依據(jù)，CD34+細(xì)胞總數(shù)和總集落形成單位(colony-formingunits,CFU)也是評估造血潛能的重要參數(shù)。臍血冷凍和復(fù)溫過程會對HSCs質(zhì)量產(chǎn)生影響[3]。本研究分析大量復(fù)溫臍血HSCs的檢測數(shù)據(jù)，旨在探究深低溫凍存和復(fù)溫過程對臍血HSCs生物學(xué)功能的影響程度，從而為臨床應(yīng)用前對臍血質(zhì)量的評估提供更有力的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臍帶血的采集 分析天津臍帶血造血干細(xì)胞庫2018至2020年度907份復(fù)溫臍血樣本。臍血采集的對象為經(jīng)篩選合格且志愿捐獻(xiàn)的足月正常分娩者，臍血采集前均經(jīng)產(chǎn)婦本人同意并簽署《臍帶血捐獻(xiàn)知情同意書》。嬰兒娩出斷臍后即從靜脈穿刺抽取臍血注入含有枸櫞酸磷酸鹽抗凝劑的采血袋中混勻，于24小時內(nèi)進(jìn)行分離處理。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀；CO2恒溫培養(yǎng)箱；程控降溫儀；血細(xì)胞分析儀。甲基纖維素培養(yǎng)基；CD34-PE；mouse IgG1-PE；CD45-FITC；7-AAD；6%羥乙基淀粉；Cryosure-DEX40細(xì)胞凍存液。

1.2 方法

1.2.1 臍血的分離與冷凍 按照本臍血庫標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將羥乙基淀粉與每份臍血以1∶4的比例充分混勻，經(jīng)二次沉淀分離法制備富含有核細(xì)胞的血漿，再與細(xì)胞凍存液以4∶1比例在冰水浴中充分混勻，轉(zhuǎn)移至冷凍袋，經(jīng)程控降溫儀降溫至-80℃后保存于-196℃液相液氮罐中。

1.2.2 臍血的復(fù)溫 將待復(fù)溫臍血的預(yù)留檢測辮管從液氮罐中取出在37℃～42℃的水浴中快速混勻融化，融化后立即抽取2mL樣本進(jìn)行各項檢測。

1.2.3 復(fù)溫臍血的檢測 應(yīng)用血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞(Whitebloodcell，WBC)，根據(jù)TNC=WBC×體積(L)計算TNC。應(yīng)用甲基纖維素培養(yǎng)基檢測CFU，將臍血標(biāo)本經(jīng)溶血、洗滌處理后制備成細(xì)胞懸液，以1×105/mL的濃度接種于24孔板內(nèi),放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，CO2濃度5%，濕度100%的條件培養(yǎng)14天，用倒置顯微鏡計數(shù)集落形成單位。根據(jù)CFU=集落形成單位計數(shù)/1×105×TNC計算CFU。按照血液病治療與移植國際聯(lián)合會(InternationalSocietyofHematotherapyandGraftEngineering，ISHAGE)方案檢測出有核細(xì)胞活率、CD34+細(xì)胞活率、CD34+細(xì)胞百分率。以CD45-FITC、CD34-PE、7-ADD標(biāo)記樣本，IgG1-PE作為同型對照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀收集75000個有核細(xì)胞，分別圈選出CD34+細(xì)胞群(即CD34+，CD45dim+，7-AAD-，lowSSC，F(xiàn)SC與淋巴細(xì)胞相似)和有核細(xì)胞群(CD45+，7-AAD-)，并用CellQuest pro軟件計算出有核細(xì)胞活率、CD34+細(xì)胞(HSCs)活率、CD34+細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，相關(guān)數(shù)據(jù)的離散程度以變異系數(shù)CV表示，凍存前后計量資料的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)溫臍帶血基本情況

907份臍血平均凍存時間為(55.26±35.19)個月；TNC凍前為(11.14±3.31)×108，復(fù)溫后為(9.67±2.89)×108，回收率為(86.86±5.99)%，變異系數(shù)CV值為6.90%；CD34+細(xì)胞總數(shù)凍前為(32.29±22.98)×105，復(fù)溫后為(37.58±27.48)×105，回收率為(120.74±36.32)%，CV值為30.08%；CFU凍前為(9.86±3.83)×105，復(fù)溫后為(9.08±4.42)×105，回收率為(96.31±40.82)%，CV值為42.38%；復(fù)溫后有核細(xì)胞活率為(91.33±4.02)%，復(fù)溫后HSCs活率為(98.86±0.13)%。見表1。

表1 復(fù)溫臍帶血基本情況

2.2 復(fù)溫臍帶血各檢測項目凍存前后的差異性分析

907份臍血復(fù)溫后TNC比凍存前顯著減少(Z=26.09，P<0.01)；CD34+細(xì)胞總數(shù)比凍存前增加的有619例，減少的有288例，與凍存前有顯著差異(Z=12.63，P<0.01)；CFU比凍存前增加的有372例，減少的有535例，與凍存前有顯著差異(Z=6.34，P<0.01)。見表2。

表2 復(fù)溫臍帶血各檢測項目凍存前后差異性分析

3 討論

臍血存儲技術(shù)在我國發(fā)展已有20余年，逐級程控降溫、冷凍保護(hù)劑的使用、凍存溫度的控制以及復(fù)溫過程的技術(shù)已經(jīng)比較成熟。細(xì)胞凍存采用甘油或二甲基亞砜作為保護(hù)劑，提高細(xì)胞膜對水的通透性；程控降溫技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成；復(fù)溫時快速融化的方法也可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化，最大程度避免對細(xì)胞的損傷。但HSCs仍因凍存、復(fù)溫過程和延長儲存時間等因素而受到損害[4]。由于臍血中細(xì)胞免疫原性較低，HLA配型成功率高，臨床篩選臍血時，多以凍存前的各項檢測數(shù)據(jù)評估臍血的質(zhì)量。但凍存前的檢測數(shù)據(jù)是否能真實(shí)反映復(fù)溫后HSCs的生物學(xué)功能呢？

在本研究中，復(fù)溫后TNC的回收率為(86.86±5.99)%，與凍存前相比顯著下降(Z=26.09，P<0.01)，表明凍存和復(fù)溫的過程會導(dǎo)致部分臍血細(xì)胞死亡。復(fù)溫后有核細(xì)胞活率為(91.33±4.02)%，CD34+細(xì)胞活率為(98.86±0.13)%，顯著高于有核細(xì)胞活率。證明了非HSCs的有核細(xì)胞受凍存復(fù)溫的影響大于HSCs。賀雪萍等[5]通過比較雙平臺ISHAGE法和單平臺絕對計數(shù)法發(fā)現(xiàn)低溫凍存后有核細(xì)胞的組分會發(fā)生變化，中性粒細(xì)胞明顯下降，CD34+細(xì)胞占比有核細(xì)胞比例比冷凍前出現(xiàn)升高趨勢，導(dǎo)致計算出的CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)、總數(shù)和回收率較凍存前升高。這也解釋了本研究中復(fù)溫后CD34+細(xì)胞總數(shù)與凍存前相比有顯著差異(Z=12.63，P<0.01)的原因。

HSCs的生物學(xué)功能包括自我更新和多向分化。在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，在半固體培養(yǎng)基上生長的CFU是由造血干(祖)細(xì)胞分化而來，因此CFU檢測能夠評估臍血中HSCs生物學(xué)功能。本研究中復(fù)溫后的CFU與凍存前相比有顯著差異(Z=6.34，P<0.01)，CFU回收率為(96.31±40.81)%，變異系數(shù)CV為42.38%，數(shù)據(jù)離散程度很大，表明CFU受凍存復(fù)溫過程的影響程度呈現(xiàn)個體差異，不具有一致性，與凍前相比減少的有535例，表明近60%的復(fù)溫HSCs樣本生物學(xué)功能有不同程度的減弱，我們推測這種差異的產(chǎn)生和新生兒的自身免疫力有著相關(guān)性。

綜上所述，臍血作為HSCs的重要資源，深低溫凍存和復(fù)溫技術(shù)日益發(fā)展，但仍對臍血中的細(xì)胞有一定程度損傷，對HSCs損傷已經(jīng)降至很低的程度，未受損傷的HSCs的增殖分化生物學(xué)功能也有著不同程度的降低。復(fù)溫后各檢測數(shù)據(jù)與凍前相比均有顯著差異，臨床應(yīng)用前對臍血的質(zhì)量評估應(yīng)以復(fù)溫后的檢測數(shù)據(jù)為主要依據(jù)。同時建議各地臍血庫應(yīng)建立臍血捐獻(xiàn)者的健康隨訪檔案，關(guān)注捐獻(xiàn)者的健康狀況，這樣做一方面可以進(jìn)一步開展影響HSCs生物學(xué)功能相關(guān)性的研究，另一方面可以對配型合格的臍血進(jìn)行全面的干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量評估，為臨床評估干細(xì)胞移植效果提供更有力的依據(jù)。