李旭陽(yáng)，鄭云鵬，金芳草，尹光文

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 鄭州 450052

尋常型銀屑病是一種免疫相關(guān)性慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)生發(fā)展與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖對(duì)銀屑病的治療尤為重要[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，LncRNA如MIR31H、MSX2P1可靶向miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能，與銀屑病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2-5]。唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子反義RNA 1(Down syndrome cell adhesion molecule-AS1，DSCAM-AS1)是一種LncRNA，位于染色體21q22.2。有報(bào)道[6]稱，DSCAM-AS1在黑色素瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，且高表達(dá)患者預(yù)后生存時(shí)間縮短，敲低其表達(dá)可降低黑色素瘤細(xì)胞的惡性行為，可作為黑色素瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。研究[7]顯示，尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-199b-3p的表達(dá)明顯低于正常人皮膚組織。炎性細(xì)胞因子如IL-22、IL-6和腫瘤壞死因子α可激活角質(zhì)形成細(xì)胞，使其過度增殖及分化，誘發(fā)尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展[8]。Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，DSCAM-AS1可能靶向結(jié)合miR-199b-3p。因此，本研究采用IL-22刺激角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT建立體外尋常型銀屑病細(xì)胞模型，觀察DSCAM-AS1/miR-199b-3p對(duì)模型細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為尋常型銀屑病的治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年2月至2019年12月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科就診的37例尋常型銀屑病患者，男14例，女23例，年齡6～57(46.3±9.2)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并紅斑狼瘡、皮肌炎、天皰瘡等自身免疫性皮膚病的患者；嚴(yán)重感染及其他疾病患者。另選同期于整形外科行整形手術(shù)者37例為正常對(duì)照，男11例，女26例，年齡5～62(45.3±8.2)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。尋常型銀屑病患者皮損組織及正常對(duì)照皮膚組織均取自腿部，約100 mg。將獲得的組織樣本用磷酸鹽緩沖液清洗后，沿組織邊緣加入1.5 mL 2.5 g/L胰蛋白酶消化24 h，分離表皮，用于檢測(cè)DSCAM-AS1與miR-199b-3p的表達(dá)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，所有受試者均簽署知情同意書。

角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購(gòu)自上海研域生物技術(shù)有限公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,DSCAM-AS1小干擾RNA(si-DSCAM-AS1)、亂序無義陰性序列(si-NC)、miR-199b-3p 模擬物和抑制劑(anti-miR-199b-3p)、模擬物陰性對(duì)照序列(miR-NC)、抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)及引物序列購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，CyclinD1、Bcl-2、Bax、IL-6受體(IL-6R)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，RNA純化試劑盒購(gòu)自天津市萊博科技有限公司。

1.2 銀屑病皮損組織及正常表皮組織中DSCAM-AS1和miR-199b-3p表達(dá)的檢測(cè)采用qRT-PCR法。RNA抽提試劑盒提取銀屑病皮損組織及正常皮膚表皮組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行PCR擴(kuò)增。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列：DSCAM-AS1上游5’-GTGACACAGCAAGACTCCCT-3’ ，下游5’-GATCCGTCGTCCATCTCTGT-3’ ；miR-199b-3p上游5’-GTCACAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游5’-TC CGACGCCGCCATCTCTA-3’ ，下游5’-TATCGCACATTAAGCCTCTA-3’；β-actin上游5’-GGCCCAGAAT GCAGTTCGCCTT-3’ ，下游5’-AATGGCACCCTGCT CACGCA-3’。PCR反應(yīng)體系：PCR預(yù)混液12.5 μL,上、下游引物各0.75 μL，cDNA模板2 μL，雙蒸水9 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DSCAM-AS1相對(duì)于β-actin、miR-199b-3p相對(duì)于U6的表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將HaCaT細(xì)胞在超凈工作臺(tái)內(nèi)復(fù)蘇，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別轉(zhuǎn)染si-DSCAM-AS1、miR-199b-3p模擬物或共轉(zhuǎn)染si-DSCAM-AS1與anti-miR-199b-3p；轉(zhuǎn)染6 h后，均用含100 μg/L IL-22的培養(yǎng)基刺激24 h，分別記為IL-22+si-DSCAM-AS1組、IL-22+miR-199b-3p組、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組。分別以轉(zhuǎn)染si-NC、miR-NC或共轉(zhuǎn)染si-DSCAM-AS1與anti-miR-NC 6 h后，IL-22刺激24 h的細(xì)胞為對(duì)照，記為IL-22+si-NC組、IL-22+miR-NC組、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組。同時(shí)設(shè)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞(NC組 )和用含100 μg/L IL-22的培養(yǎng)基處理24 h的細(xì)胞 (IL-22組)為對(duì)照。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)取HaCaT細(xì)胞接種于96孔板(1.0×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，按1.3分組處理24 h。然后每孔加10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，代表細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)取HaCaT細(xì)胞接種于12孔板(5.0×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，按1.3分組處理24 h。收集細(xì)胞，用PBS清洗2次。取各組細(xì)胞懸液(約含1.0×106個(gè)細(xì)胞)，1 500 r/min離心5 min后，加500 μL結(jié)合緩沖液，混懸細(xì)胞。再依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2、IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot法。取HaCaT細(xì)胞接種于6孔板(2.5×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，按1.3分組處理24 h。收集細(xì)胞，用PBS清洗2次。然后用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及50 g/L脫脂奶粉溶液封閉后，加一抗(CyclinD1、Bax、Bcl-2按1∶500稀釋，IL-6R、STAT3和β-actin按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。加山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。滴加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)于β-actin的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)取HaCaT細(xì)胞接種于6孔板(5.0×105個(gè)/孔)，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別共轉(zhuǎn)染野生型(WT)DSCAM-AS1與miR-199b-3p模擬物或miR-NC，突變型(MUT)DSCAM-AS1與miR-199b-3p模擬物或miR-NC(上海生工生物工程股份有限公司)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解。3 500 r/min離心5 min后，取上清，參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較正常皮膚組織和銀屑病皮損組織以及NC組和IL-22組細(xì)胞DSCAM-AS1和miR-199b-3p表達(dá)水平的差異；采用單因素方差分析比較NC組、IL-22組、IL-22+si-NC和IL-22+si-DSCAM-AS1組細(xì)胞增殖能力，凋亡率，DSCAM-AS1、CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較IL-22+miR-NC組和IL-22+miR-199b-3p組以及IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組和IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組細(xì)胞增殖能力，凋亡率，miR-199b-3p及CyclinD1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病皮損組織中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表達(dá)與正常皮膚組織比較，銀屑病皮損組織中DSCAM-AS1表達(dá)增高，miR-199b-3p表達(dá)降低。見表1。

表1 銀屑病皮損組織中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表達(dá)

2.2 IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表達(dá)與NC組比較，IL-22組HaCaT細(xì)胞中DSCAM-AS1表達(dá)增高，miR-199b-3p表達(dá)降低。見表2。

表2 IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞中DSCAM-AS1和miR-199b-3p的表達(dá)

2.3 敲減DSCAM-AS1對(duì)IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與NC組比較，IL-22組HaCaT細(xì)胞DSCAM-AS1表達(dá)增強(qiáng)，A值升高，凋亡率降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)減少；與IL-22+si-NC組比較，IL-22+si-DSCAM-AS1組DSCAM-AS1表達(dá)減弱，HaCaT細(xì)胞A值降低，凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加；而IL-22組與IL-22+si-NC組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表3。

1～4：分別為NC組、IL-22組、IL-22+si-NC組、IL-22+si-DSCAM-AS1組

表3 敲減DSCAM-AS1對(duì)IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果Starbase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，DSCAM-AS1與miR-199b-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)提示DSCAM-AS1可靶向結(jié)合miR-199b-3p。

圖2 miR-199b-3p和DSCAM-AS1的結(jié)合位點(diǎn)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 過表達(dá)miR-199b-3p對(duì)IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與IL-22+miR-NC組比較，IL-22+miR-199b-3p組HaCaT細(xì)胞miR-199b-3p的表達(dá)升高，A值降低，凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加。見圖3、表5。

1、2：分別為IL-22+miR-NC組和IL-22+miR-199b-3p組

表5 過表達(dá)miR-199b-3p對(duì)IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 敲減miR-199b-3p對(duì)IL-22刺激下敲減DSCAM-AS1的HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響與IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組比較，IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組HaCaT細(xì)胞中miR-199b-3p表達(dá)降低，A值升高，凋亡率降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)減少。見圖4、表6。

1、2：分別為IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組和IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組

表6 敲減miR-199b-3p對(duì)IL-22刺激下敲減DSCAM-AS1的HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7 各組細(xì)胞IL-6R/STAT3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)與NC組比較，IL-22組HaCaT細(xì)胞中IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)增加；與IL-22+si-NC組比較，IL-22+si-DSCAM-AS1組HaCaT細(xì)胞中IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)減少；與IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組比較，IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組HaCaT細(xì)胞中IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)增加。見圖5、表7。

1～6:分別為NC組、IL-22組、IL-22+si-NC組、IL-22+si-DSCAM-AS1組、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組、IL-22+si-DSCAM-AS1+anti-miR-199b-3p組

表7 各組細(xì)胞IL-6R、STAT3蛋白的表達(dá)情況

3 討論

DSCAM-AS1作為一種LncRNA，目前對(duì)其研究多集中于腫瘤方面。研究[9-11]顯示，DSCAM-AS1在結(jié)腸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)升高，起促癌基因作用，敲低其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究結(jié)果顯示，DSCAM-AS1在尋常型銀屑病皮損組織及IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中表達(dá)增加，敲減DSCAM-AS1抑制了IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，并加劇細(xì)胞凋亡，推測(cè)DSCAM-AS1可作為潛在的尋常型銀屑病的分子治療靶點(diǎn)。細(xì)胞增殖和凋亡受多種基因分子的調(diào)控，其中CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控分子，其表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞增殖[12]。Bax/Bcl-2參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bax發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl-2是抗凋亡分子，其表達(dá)增加時(shí)與Bax形成異源二聚體，減弱Bax的促凋亡作用[13]。本研究結(jié)果顯示，敲減DSCAM-AS1降低了IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞中CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了Bax蛋白的表達(dá)，提示敲減DSCAM-AS1抑制IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡與其參與調(diào)控CyclinD1、Bax/Bcl-2等增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

為了進(jìn)一步探究DSCAM-AS1影響IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，本研究首先通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DSCAM-AS1可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-199b-3p，這也與本研究中尋常型銀屑病皮損組織及IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞中DSCAM-AS1表達(dá)增加而miR-199b-3p表達(dá)減少的結(jié)果一致。miR-199b-3p參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程，例如其在大腦中動(dòng)脈閉塞-再灌注小鼠腦組織中表達(dá)缺失，上調(diào)miR-199b-3p可通過阻斷MAPK/ERK/EGR1軸增強(qiáng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，并抑制其凋亡，減輕小鼠腦組織損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-199b-3p可抑制IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并加劇細(xì)胞凋亡，敲減miR-199b-3p可逆轉(zhuǎn)敲減DSCAM-AS1對(duì)IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，提示DSCAM-AS1可能通過靶向抑制miR-199b-3p來促進(jìn)尋常型銀屑病的發(fā)展，上調(diào)miR-199b-3p有可能起到治療銀屑病的目的。

尋常型銀屑病的病理機(jī)制尚未明確，其發(fā)生發(fā)展與病灶內(nèi)異常浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞及其所產(chǎn)生的炎癥因子有關(guān)[15]。IL-6在銀屑病發(fā)生后表達(dá)升高，可與其受體IL-6R結(jié)合生成異源二聚體，并結(jié)合至gpl30上，形成高親和力復(fù)合物IL-6/IL-6R/gpl30作用于IL-6R/JAK/STAT3信號(hào)通路，加重銀屑病病情[16]。有報(bào)道[17]稱，尋常型銀屑病血熱證患者外周血白細(xì)胞中IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)明顯升高，IL-6R/STAT3參與銀屑病的發(fā)展進(jìn)程；IL-6抑制劑可通過抑制IL-6R/JAK/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路有效降低銀屑病大鼠背部皮膚組織角質(zhì)增殖及炎癥反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)IL-22刺激后，IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)增加，說明IL-22刺激激活了角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-6R/STAT3通路；而敲減DSCAM-AS1后IL-6R和STAT3蛋白表達(dá)降低，說明敲減DSCAM-AS1可抑制IL-6R/STAT3通路的激活；同時(shí)，敲減miR-199b-3p逆轉(zhuǎn)了敲減DSCAM-AS1對(duì)IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-6R/STAT3通路的抑制作用，進(jìn)一步提示DSCAM-AS1通過靶向抑制miR-199b-3p并激活I(lǐng)L-6R/STAT3通路，促進(jìn)尋常型銀屑病的進(jìn)程。

綜上，DSCAM-AS1在尋常型銀屑病皮損組織及IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)增加，敲減其表達(dá)可抑制IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與靶向miR-199b-3p并阻斷IL-6R/STAT3信號(hào)通路有關(guān)，DSCAM-AS1/miR-199b-3p軸可能為尋常型銀屑病的治療提供了新的分子靶點(diǎn)。