李勃， 魯瑩， 萬(wàn)琪， 梁璇， 楊沂文， 韓勇， 曾俊偉

· 論著 ·

miR-29c通過(guò)下調(diào)TNFR1信號(hào)通路減輕TNF-α誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷*

李勃， 魯瑩， 萬(wàn)琪， 梁璇， 楊沂文， 韓勇， 曾俊偉△

（遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000）

探討微小RNA-29c（microRNA-29c， miR-29c）對(duì)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷效應(yīng)的影響及機(jī)制。構(gòu)建慢病毒（lentivirus， LV）介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)/低表達(dá)miR-29c的小鼠海馬神經(jīng)元HT22，分為空載體細(xì)胞株（LV-vector）組、LV-vector+TNF-α組、miR-29c過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（LV-miR-29c）+TNF-α組和miR-29c低表達(dá)細(xì)胞株（LV-miR-29c sponge）+TNF-α組。采用CCK-8法和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)TNF-α對(duì)HT22細(xì)胞的毒性作用；免疫熒光染色觀察腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1， TNFR1）的表達(dá)；RT-qPCR檢測(cè)miR-29c和TNFR1 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)TNFR1、TNFR相關(guān)死亡域蛋白（TNFR-associated death domain protein， TRADD）、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein， FADD）、pro-caspase-8、cleaved caspase-8、pro-caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平；Hoechst和TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。（1）CCK-8和LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組細(xì)胞活力顯著下降（<0.05），且LDH釋放顯著增多（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組細(xì)胞活力顯著上升（<0.05），且LDH釋放顯著減少（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組細(xì)胞活力顯著下降（<0.05），且LDH釋放顯著增多（<0.05）。（2）RT-qPCR和免疫熒光結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組TNFR1表達(dá)顯著增多（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組TNFR1表達(dá)顯著減少（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組TNFR1表達(dá)顯著增多（<0.05）。（3）Western blot結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組細(xì)胞中TNFR1、TRADD、FADD、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組TNFR1、TRADD、FADD、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白水平表達(dá)顯著下調(diào)（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組TNFR1、TRADD、FADD、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)（<0.05）。（4）Hoechst和TUNEL染色結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著減少（<0.05），而LV-miR-29c+sponge+TNF-α組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（<0.05）。miR-29c減輕TNF-α誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與抑制TNFR1信號(hào)通路激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

微小RNA-29c；腫瘤壞死因子α；TNFR1信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡；海馬神經(jīng)元

海馬腦區(qū)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分之一，在痛覺感受、情緒體驗(yàn)以及學(xué)習(xí)記憶等功能中發(fā)揮重要作用。在阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）、腦缺血再灌注損傷和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變進(jìn)展過(guò)程中，均可見到在海馬腦區(qū)炎癥因子的積聚，這可誘發(fā)神經(jīng)元的損傷甚至凋亡［1-4］。在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，往往伴隨海馬腦區(qū)微小RNA（microRNA， miRNA， miR）表達(dá)譜及多種炎癥因子的表達(dá)發(fā)生改變，提示這些miRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)海馬炎癥，促進(jìn)神經(jīng)元損傷，參與病變進(jìn)展［5-6］。

miR-29c是miR-29s家族成員之一，作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，在心臟、肝臟、子宮及肌肉組織中表達(dá)較低，而在大腦和脊髓處于高水平表達(dá)［7］。在缺血再灌注小鼠海馬組織和氧糖剝奪損傷的PC12細(xì)胞中均可見miR-29c表達(dá)下降，但腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1， TNFR1）及炎癥因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6和TNF-α表達(dá)增加［8］。在坐骨神經(jīng)損傷性疼痛的大鼠，海馬組織中miR-29c的表達(dá)下降近70％；在脊神經(jīng)損傷小鼠，海馬小膠質(zhì)細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）增多，作用于神經(jīng)元TNFR1，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，可見神經(jīng)元樹突分支減少，樹突棘密度降低，但這些變化在基因敲除后顯著減輕［9-10］。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-29c可與TNFR1 mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region， 3'-UTR）結(jié)合，導(dǎo)致TNFR1表達(dá)下調(diào)［11］。因此，有必要深入研究miR-29c是否可以通過(guò)下調(diào)TNFR1表達(dá)，抑制TNFR1下游通路激活導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷。

HT22細(xì)胞是一種源于小鼠的永生化海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究實(shí)驗(yàn)中［12］。有研究報(bào)道，TNF-α作用于HT22細(xì)胞可以導(dǎo)致其細(xì)胞活力下降且凋亡率上升［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用TNF-α誘發(fā)HT22細(xì)胞損傷，以慢病毒（lentivirus， LV）轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-29c過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，觀察miR-29c過(guò)表達(dá)或低表達(dá)是否影響TNF-α誘發(fā)的HT22細(xì)胞損傷，探討miR-29c是否可以抑制TNFR1的表達(dá)及后續(xù)的細(xì)胞凋亡，以期在細(xì)胞水平上明確miR-29c對(duì)TNF-α/TNFR1通路激活導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷的抑制作用。

材料和方法

1　主要材料與試劑

小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection， ATCC）；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購(gòu)自MRC；DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購(gòu)自HyClone；兔抗Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein， FADD）多克隆抗體、兔抗TNFR1多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體和山羊抗兔Cy3熒光Ⅱ抗均購(gòu)自Proteintech；兔抗cleaved caspase-3單克隆抗體和兔抗cleaved caspase-8單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗TNFR相關(guān)死亡域蛋白（TNFR-associated death domain protein， TRADD）多克隆抗體和兔抗GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自HuaBio；兔抗pro-caspase-3單克隆抗體、兔抗pro-caspase-8單克隆抗體和小鼠TNF-α重組蛋白均購(gòu)自Abcam；引物設(shè)計(jì)與合成和慢病毒包裝與合成均由上海生工有限公司提供；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）檢測(cè)試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Cy3-dUTP）均購(gòu)自上海碧云天生物科技公司；Hoechst 33258染色液購(gòu)自北京索萊寶公司；Triozl試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光染料試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

2　主要儀器與設(shè)備

激光掃描共聚焦顯微鏡Airyscan 2購(gòu)自Zeiss；NanoDrop 2000/2000C、低溫高速離心機(jī)、QuantStudioTM6 Flex PCR儀和FORM Series ll Water Jacket CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；熒光顯微鏡和倒置相差顯微鏡購(gòu)自Leica；電泳槽、電泳儀和半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad；全能型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Syngene。

3　方法

3.1構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的miR-29c過(guò)表達(dá)/低表達(dá)的HT22細(xì)胞株取狀態(tài)良好的HT22細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種至24孔板中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5％ CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到30％～50％后，按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infect， MOI）=120配制含有病毒原液的培養(yǎng)液進(jìn)行病毒感染，24 h后吸棄含有病毒的培養(yǎng)液，換含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）的表達(dá)效率。將適量嘌呤霉素加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，直到存活細(xì)胞的EGFP表達(dá)效率達(dá)到90％以上。本實(shí)驗(yàn)中，miR-29c sponge的序列含有8段重復(fù)序列（5'-TAACCGATTTTTTTGGTGCTA-3'），可以與miR-29c（5'-TAGCACCATTTGAAATCGGTTA-3'）結(jié)合。

3.2實(shí)驗(yàn)分組將慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的空載體（LV-vector）、miR-29c過(guò)表達(dá)（LV-miR-29c）及miR-29c低表達(dá)（LV-miR-29c sponge）HT22細(xì)胞分為以下4組：LV-vector組、LV-vector+TNF-α組、LV-miR-29c+TNF-α組和LV-miR-29c sponge+TNF-α組。

3.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將HT22細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為每孔7 000個(gè)。各組細(xì)胞處理完畢后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入孵箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔吸光度（absorbance，）。按照下述公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞活力（%）=（加藥組-空白組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。

3.4LDH釋放檢測(cè)將HT22細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為每孔7 000個(gè)。將培養(yǎng)孔進(jìn)行以下分組：（1）無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔；（2）未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔；（3）未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔；（4）藥物處理的細(xì)胞孔。標(biāo)記好后常規(guī)培養(yǎng)。檢測(cè)前1 h，從孵箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在（3）中加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。1 h過(guò)后開始檢測(cè)，離心（400×， 5 min），取120 μL各孔的上清液并加入到新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即在各孔分別加入LDH檢測(cè)工作液50 μL混勻（乳酸溶液∶INT溶液∶酶溶液=1∶1∶1），室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各組值，并將得到的值［（1）、（2）、（3）和（4）組的值分別為1、2、3和4］按照下述公式進(jìn)行計(jì)算：LDH釋放率（%）=（4-2）/（3-2）×100%。

3.5細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)HT22細(xì)胞接種于蓋玻片上（每孔1×105）并放于孵箱培養(yǎng)24 h后給予TNF-α（400 μg/L，24 h）。棄去上清液后用PBS漂洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3～4次，每次5 min；加入兔抗TNFR1單克隆抗體（1∶350）覆蓋于玻片上，37 ℃避光孵育1 h后置于4 ℃冰箱過(guò)夜。次日，用PBS漂洗3～4次，每次5 min，隨后加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶350），37 ℃避光孵育30 min，室溫避光孵育1 h后取出；加入DAPI（1∶500，5 min）標(biāo)記細(xì)胞核；甘油+PBS（體積比1∶1）封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，使用ZEN軟件處理得到單細(xì)胞熒光強(qiáng)度數(shù)值（每組不少于100個(gè)細(xì)胞）。

3.6Western blot各組細(xì)胞棄去上清，按照BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。步驟如下：預(yù)冷的PBS（PH 7.4）清洗后加入裂解液，將細(xì)胞刮下。4 ℃靜置半小時(shí)，低溫高速（4 ℃，4 500×）離心5 min，提取上清后加入上樣緩沖液，熱變性。每孔30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE分離，膜轉(zhuǎn)移，用含5%脫脂奶粉的 TBST 緩沖液封閉2 h。分別孵育兔抗TNFR1（1∶500）、TRADD（1∶500）、FADD（1∶500）、pro-caspase-3（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、pro-caspase-8（1∶1 000）、cleaved caspase-8（1∶1 000）、β-actin（1：4 000）和GAPDH（1∶8 000）抗體，4 ℃過(guò)夜。膜清洗15 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶4 000），室溫孵育1 h，洗膜、顯色曝光。所有數(shù)據(jù)采取ImageJ 1.48軟件處理。

3.7RT-qPCR使用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。miR-29c的上游引物序列為5′-CGCGTAGCACCATTTGAAAT-3′，下游引物序列5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；TNFR1的上游引物序列為5′-CCGGGAGAAGAGGGATAGCTT-3′，下游引物序列為5′-TCGGACAGTCACTCACCAAGT-3′；β-actin的上游引物序列為5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物序列為5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。分別以β-actin和U6為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)各組Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.8Hoechst染色HT22細(xì)胞正常消化，接種于蓋玻片上（每孔1×105）并放于孵箱培養(yǎng)24 h后給予TNF-α（400 μg/L，24 h）處理。棄去上清液后用PBS漂洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加入Hoechst 33258 （10 mg/L）染色液在室溫下避光孵育5 min，PBS漂洗后封片（甘油∶PBS=1∶1），倒置熒光顯微鏡下觀察胞核形態(tài)變化并拍照，細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)色橢圓形為正常細(xì)胞，細(xì)胞核呈現(xiàn)高亮藍(lán)色皺縮為凋亡細(xì)胞，采用以下公式計(jì)算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.9TUNEL染色HT22細(xì)胞正常消化，接種于蓋玻片上（每孔1×105）并放于孵箱培養(yǎng)24 h后給予TNF-α（400 μg/L，24 h）處理。棄去上清液后用PBS漂洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；之后選用0.3% Triton X-100處理5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；然后按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色。每張玻片滴加 TUNEL反應(yīng)混合液30 μL（TdT酶∶熒光標(biāo)記液=1∶9），然后置于暗濕盒中，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；然后用DAPI溶液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行避光染色5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，在激光共聚焦顯微鏡下拍照并保存好圖像資料。細(xì)胞發(fā)生凋亡后，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的黏性3'-OH末端，可以在TdT酶的催化下加上紅色熒光探針Cy3標(biāo)記的dUTP，進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，采用以下公式計(jì)算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100%。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。組間均數(shù)比較選用單因素方差分析，方差齊選用Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)/低表達(dá)miR-29c的HT22細(xì)胞株

在熒光顯微鏡下可見慢病毒感染后的HT22細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光；RT-qPCR結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-miR-29c組中的miR-29c表達(dá)顯著上調(diào)（<0.05），而LV-miR-29c sponge組中的miR-29c表達(dá)顯著下調(diào)（<0.05），見圖1。這提示空載體慢病毒轉(zhuǎn)染（LV-vector）、miR-29c過(guò)表達(dá)（LV-miR-29c）及miR-29c低表達(dá)（LV-miR-29c sponge）的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞株均已構(gòu)建。

Figure 1.　Establishment of stable HT22 cell line with overexpression or low expression of miR-29c. A： the HT22 cells in LV-vector， LV-miR-29c and LV-miR-29c sponge groups were detected by fluorescence microscopy after lentiviral transfection （top row： observation under green fluorescence； bottom row： observation under white light； scale bar=100 μm）； B： RT-qPCR analysis of miR-29c expression in the HT22 cells transfected with LV-vector， LV-miR-29c or LV-miR-29c sponge. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs LV-vector group； #P<0.05 vs LV-miR-29c group.

2　miR-29c減輕TNF-α導(dǎo)致的HT22細(xì)胞損傷

CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組細(xì)胞活力顯著下降，且當(dāng)濃度為400 μg/L的TNF-α作用24 h后，細(xì)胞活力下降近50％（<0.05），見圖2A。于是后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用該濃度檢測(cè)miR-29c對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞活力下降的影響。與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組的細(xì)胞活力顯著上升（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組的細(xì)胞活力顯著下降（<0.05），見圖2B。

同時(shí)，LDH釋放檢測(cè)結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組LDH釋放顯著增多（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組LDH釋放顯著減少，而LV-miR-29c sponge+TNF-α組細(xì)胞LDH釋放顯著增多（<0.05），見圖2C。

倒置相差顯微鏡下觀察，LV-vector組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈貼壁性生長(zhǎng)；而LV-vector+TNF-α組部分細(xì)胞皺縮變圓，貼壁不緊有脫落現(xiàn)象；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組上述表現(xiàn)有所緩解；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c sponge+TNF-α組細(xì)胞損傷現(xiàn)象進(jìn)一步加重，見圖2D。

Figure 2.　miR-29c overexpression protected HT22 cells from TNF-α-induced injury. A and B： cell viability was measured by CCK-8 assay； C： cytotoxicity was measured by LDH release assay； D： morphological changes of HT22 cells were observed（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=6. ▲P<0.05 vs vehicle group； *P<0.05 vs LV-vector group； △P<0.05 vs LV-vector+TNF-α group； #P<0.05 vs LV-miR-29c+TNF-α group.

3　miR-29c抑制TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中TNFR1表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果所示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組細(xì)胞中TNFR1熒光強(qiáng)度顯著升高（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組細(xì)胞TNFR1熒光強(qiáng)度顯著下降（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組細(xì)胞TNFR1熒光強(qiáng)度顯著升高（<0.05），見圖3A。

RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組的TNFR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組細(xì)胞TNFR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào)（<0.05），而LV-miR-29c sponge+TNF-α組TNFR1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著上調(diào)（<0.05），見圖3B、C。

Figure 3.　miR-29c overexpression inhibited TNF-α-induced the expression of TNFR1 in HT22 cells.A： immunofluorescence staining of TNFR1 （scale bar=50 μm） and the mean fluorescence intensity per cell （≥100 cells）； B： RT-qPCR analysis of TNFR1 mRNA level； C： Western blot was applied to detect the protein expression of TNFR1. Mea±SD. n=4. *P<0.05 vs LV-vector group； △P<0.05 vs LV-vector+TNF-α group； #P<0.05 vs LV-miR-29c+TNF-α group.

4　miR-29c抑制TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中TNFR1信號(hào)通路的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，在4組細(xì)胞中，pro-caspase-8的變化無(wú)顯著差異。與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組中TRADD、FADD和cleaved caspase-8的蛋白水平均顯著上調(diào)（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組中TRADD、FADD和cleaved caspase-8的蛋白水平顯著下調(diào)（<0.05）；而LV-miR-29c sponge+TNF-α組中TRADD、FADD和cleaved caspase-8的蛋白水平顯著上調(diào)（<0.05）。見圖4。

Figure 4.　miR-29c overexpression inhibited TNF-α-induced expression of TNFR1 signaling pathway-related proteins in HT22 cells. A： Western blot was applied to detect the protein levels of TRADD and FADD； B： Western blot was applied to detect the protein levels of pro-caspase-8 and cleaved caspase-8. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs LV-vector group； △P<0.05 vs LV-vector+TNF-α group； #P<0.05 vs LV-miR-29c+TNF-α group.

5　miR-29c減輕TNF-α導(dǎo)致的HT22細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，在4組細(xì)胞中，pro-caspase-3變化無(wú)顯著差異。與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上調(diào)（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著下調(diào)（<0.05）；而LV-miR-29c sponge+TNF-α組中cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上調(diào)（<0.05）。見圖5A。

Hoechst染色觀察到，在熒光顯微鏡下，LV-vector組細(xì)胞核大多呈現(xiàn)彌散均勻熒光；與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組細(xì)胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，且光亮度增加，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組雖然也有部分高亮藍(lán)色皺縮形的凋亡細(xì)胞，但數(shù)目顯著減少（<0.05），LV-miR-29c sponge+TNF-α組高亮藍(lán)色皺縮形的凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多（<0.05），見圖5B。

TUNEL染色結(jié)果顯示，與LV-vector組相比，LV-vector+TNF-α組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增加（<0.05）；與LV-vector+TNF-α組相比，LV-miR-29c+TNF-α組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（<0.05），LV-miR-29c sponge+TNF-α組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（<0.05），見圖5C。

討論

在海馬腦區(qū)，TNF-α/TNFR1信號(hào)通路的異常激活促進(jìn)了神經(jīng)炎癥和和神經(jīng)元的凋亡過(guò)程，參與了如腦外傷、腦卒中、阿爾茲海默癥和帕金森癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變進(jìn)程［14-16］。因此，如何抑制TNF-α/TNFR1信號(hào)通路過(guò)度激活已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。鑒于miR-29c作為一個(gè)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，高表達(dá)于人類和嚙齒類動(dòng)物的海馬組織，因此，有必要深入探討miR-29c對(duì)受損海馬神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用并探討其機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α刺激小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，LDH釋放增加，甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。然而，在HT22細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-29c后可以顯著減輕TNF-α誘導(dǎo)的上述細(xì)胞損傷；相反，在HT22細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c sponge之后，miR-29c表達(dá)下降，而且由于miR-29c sponge與miR-29c的結(jié)合，導(dǎo)致miR-29c的保護(hù)作用大大減弱，因此TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重。由此可見，miR-29c對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的小鼠HT22海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不同于在體神經(jīng)元所處的細(xì)胞環(huán)境，研究結(jié)果具有一定的局限性，但這些結(jié)果還是提示miR-29c具有神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)，有望成為治療炎癥和凋亡相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

以往研究報(bào)道，TNF-α通過(guò)TNFR1途徑介導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡［17］。而且，在U251人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，miR-29c和TNFR1之間的調(diào)控關(guān)系通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)得到驗(yàn)證［11］。因此，本研究檢測(cè)miR-29c是否通過(guò)影響TNFR1的表達(dá)及下游途徑的激活發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)。通過(guò)免疫熒光染色、RT-qPCR和Western blot技術(shù)觀察到，TNF-α作用于HT22細(xì)胞，導(dǎo)致TNFR1表達(dá)升高，而miR-29c過(guò)表達(dá)可顯著抑制TNFR1的表達(dá)，但在HT22細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c sponge后，miR-29c表達(dá)下降，TNFR1的表達(dá)處于高水平，這充分說(shuō)明miR-29c可以負(fù)向調(diào)節(jié)TNFR1的表達(dá)。

TNFR1具有一個(gè)可以募集TRADD和FADD的胞質(zhì)死亡域，通過(guò)活化caspase-8從而與位于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的caspase-3結(jié)合并使其激活，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生［18-19］。另外，有研究報(bào)道，在酗酒模型大鼠的海馬組織，TNFR1、TRADD和FADD表達(dá)同時(shí)上調(diào)，而且三者形成復(fù)合物，這對(duì)caspase-8激活至關(guān)重要；在烏頭堿誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡中也觀察到FADD和caspase-8表達(dá)同步增加［20-22］。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29c對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，TNF-α處理HT22細(xì)胞后，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，TNFR1、TRADD、FADD、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高。過(guò)表達(dá)miR-29c后，TNF-α作用于HT22細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，TNFR1、TRADD和FADD的表達(dá)降低，活化型的caspase-8和caspase-3表達(dá)下降；相反，當(dāng)miR-29c的表達(dá)被抑制后，TNF-α誘導(dǎo)的上述凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)更加明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多。雖然本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有直接探討miR-29c對(duì)TNFR1-FADD-TRADD復(fù)合物形成的影響，但目前結(jié)果仍然提示miR-29c可能通過(guò)抑制TNFR1信號(hào)通路從而減輕TNF-α誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡。這也是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)局限之處。miR-29c對(duì)TNFR1-FADD-TRADD復(fù)合物結(jié)合的影響有待后續(xù)研究。

miRNAs通過(guò)與靶基因特異性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯阻滯，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［23］。miRNA可與多個(gè)mRNA下游靶點(diǎn)結(jié)合，并且多個(gè)miRNA也可調(diào)控同一個(gè)mRNA下游靶點(diǎn)。此外，氧糖剝奪/復(fù)氧處理的HT22細(xì)胞中miR-29c水平降低，導(dǎo)致其直接靶點(diǎn)Map2k6的表達(dá)增加，促進(jìn)凋亡發(fā)生［8］。在本研究中，miR-29c對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用有可能是通過(guò)調(diào)控多種mRNA下游靶點(diǎn)產(chǎn)生的。未來(lái)還需要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、RNA測(cè)序與雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等進(jìn)一步探索與確認(rèn)miR-29c可以影響哪些mRNA下游靶點(diǎn)的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，TNF-α誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷后，TNFR1信號(hào)通路被激活，TRADD、FADD及活化型cleaved caspase-8/-3蛋白水平升高，細(xì)胞凋亡率上升；通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使HT22細(xì)胞中miR-29c表達(dá)上調(diào)后，TNF-α誘導(dǎo)的上述效應(yīng)顯著減輕，提示miR-29c的神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)可能是抑制TNFR1信號(hào)通路過(guò)度激活，從而緩解TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

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miR-29c attenuates TNF-α-induced injury of mouse hippocampal neuronal HT22 cells via inhibition of TNFR1 signaling pathway

LI Bo， LU Ying， WAN Qi， LIANG Xuan， YANG Yi-wen， HAN Yong， ZENG Jun-wei△

（，，563000，）

To investigate the effect and mechanism of microRNA-29c （miR-29c） on tumor necrosis factor-α （TNF-α）-induced mouse hippocampal neuronal HT22 cell injury.Overexpression and low expression of miR-29c were performed by lentivirus （LV） transfection in mouse hippocampal neuronal HT22 cells. The HT22 cells were divided into LV-vector （cell line with empty vector） group， LV-vector+TNF-α group， LV-miR-29c （cell line with overexpression of miR-29c）+TNF-α group and LV-miR-29c sponge （cell line with low expression of miR-29c）+TNF-α group. The toxicity of TNF-α to HT22 cells was evaluated by CCK-8 and lactate dehydrogenase （LDH） release assays. The expression of tumor necrosis factor receptor 1 （TNFR1） was observed by immunofluorescence staining. The expression of miR-29c and TNFR1 mRNA was detected by RT-qPCR. The protein levels of TNFR1， TNFR-associated death domain protein （TRADD）， Fas-associated death domain protein （FADD）， pro-caspase-8， cleaved caspase-8， pro-caspase-3 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. Apoptosis was observed via TUNEL staining and Hoechst 33258 staining.（1） The results of CCK-8 and LDH release assays showed that compared with LV-vector group， the cell viability was significantly decreased in LV-vector+TNF-α group （<0.05）， and the release of LDH was significantly increased （<0.05）. Compared with LV-vector+TNF-α group， the cell viability was significantly increased in LV-miR-29c+TNF-α group （<0.05）， and the release of LDH was significantly decreased （<0.05）. However， decreased cell viability induced by TNF-α was substantially deteriorated in LV-miR-29c sponge+TNF-α group. （2） The results of RT-qPCR and immunofluorescence staining showed that compared with LV-vector group， the expression of TNFR1 in LV-vector+TNF-α group was significantly increased （<0.05）. Compared with LV-vector+TNF-α group， the expression of TNFR1 in LV-miR-29c+TNF-α group was significantly decreased （<0.05）， while that in LV-miR-29c sponge+TNF-α group was significantly increased （<0.05）. （3） The results of Western blot showed that compared with LV-vector group， the protein levels of TNFR1， TRADD， FADD， cleaved caspase-8 and cleaved caspase-3 in LV-vector+TNF-α group were significantly increased （<0.05）. Compared with LV-vector+TNF-α group， the protein levels of TNFR1， TRADD， FADD， cleaved caspase-8 and cleaved caspase-3 in LV-miR-29c+TNF-α group were significantly decreased （<0.05）， while those in LV-miR-29c sponge+TNF-α group were significantly increased （<0.05）. （4） The results of Hoechst and TUNEL staining showed that the number of apoptotic cells in LV-vector group was significantly increased after TNF-α application （<0.05）. Compared with LV-vector+TNF-α group， the number of apoptotic cells in LV-miR-29c+TNF-α group was significantly decreased （<0.05）， while that in LV-miR-29c sponge+TNF-α group was significantly increased （<0.05）.miR-29c attenuates the injury of mouse hippocampal neuronal HT22 cells induced by TNF-α， and its mechanism may be related to the inhibition of TNFR1 signaling pathway.

MicroRNA-29c； Tumor necrosis factor-α； TNFR1 signaling pathway； Apoptosis； Hippocampal neurons

1000-4718（2022）09-1537-10

2022-04-07

2022-07-29

13765253805； E-mail： junweizeng@sohu.com

R338.2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.001

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 31860291）；貴州省教育廳創(chuàng)新群體重大研究項(xiàng)目（黔教合KY字［2018］025）

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）