柳紅英， 丁璐， 王卉， 范桄溥

GPX4 m6A修飾在膿毒癥誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺上皮細(xì)胞鐵死亡過程中的調(diào)控作用*

柳紅英1， 丁璐1， 王卉1， 范桄溥2△

（北京大學(xué)人民醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2心外科，北京 100044）

分析在膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺上皮細(xì)胞系MLE-12凋亡和小鼠急性肺損傷（ALI）過程中鐵死亡的作用，并探討谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）在這一過程的調(diào)節(jié)作用。體外實驗1將MLE-12細(xì)胞分為對照組、鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）組、脂多糖（LPS）組和LPS+Fer-1組，以考察鐵死亡參與LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡；實驗2將細(xì)胞分為：載體組和GPX4組，以考察GPX4對LPS刺激誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞損傷的影響；實驗3將細(xì)胞分為：si-WTAP+si-NC組和si-WTAP+si-GPX4組，以考察Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）對GPX4驅(qū)動的鐵死亡影響。LPS刺激MLE-12細(xì)胞建立體外模型，然后將細(xì)胞用Fer-1和轉(zhuǎn)染GPX4過表達(dá)質(zhì)粒、WTAP特異性siRNA（si-WTAP）、GPX4特異性siRNA（si-GPX4）進(jìn)行處理。分別通過CCK-8測定細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，DCFH-DA測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平和Western blot分析GPX4和WTAP表達(dá)水平。體內(nèi)實驗將小鼠隨機分為4組：對照組、假手術(shù)組、盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）12 h組和CLP 24 h組，每組12只。進(jìn)行H&E染色以評估小鼠的肺損傷，并采用試劑盒法檢測肺勻漿中的鐵含量、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平。與對照組相比，隨著LPS暴露時間的延長，細(xì)胞中ROS水平和Fe2+水平顯著增加（<0.05），鐵死亡標(biāo)志物GPX4的蛋白表達(dá)逐漸降低，WTAP蛋白水平以及WTAP/GPX4比例顯著增加（<0.05）。相對于LPS組，在LPS+ Fer-1組中細(xì)胞活力顯著增加（<0.05），細(xì)胞凋亡百分率、ROS水平和Fe2+水平顯著降低（<0.05）。與載體組相比，GPX4組細(xì)胞中GPX4表達(dá)及細(xì)胞活力顯著增加（<0.05），細(xì)胞凋亡百分比、ROS水平和Fe2+水平顯著降低（<0.05）。與si-WTAP+si-NC組相比，si-WTAP+si-GPX4組MLE-12細(xì)胞中ROS水平和Fe2+水平顯著增加（<0.05）。與假手術(shù)組相比，CLP 12 h組和CLP 24 h組小鼠肺組織學(xué)評分和肺勻漿中鐵含量、MDA水平和WTAP蛋白表達(dá)顯著升高（<0.05），肺組織中GPX4蛋白表達(dá)和GSH水平顯著降低（<0.05）。WTAP介導(dǎo)的m6A修飾可能是GPX4的上游目標(biāo)，并通過降低GPX4水平以促進(jìn)膿毒癥誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡和小鼠ALI過程中的鐵死亡。

膿毒癥；急性肺損傷；肺上皮細(xì)胞；鐵死亡；谷胱甘肽過氧化物酶4

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）的特點是肺部出現(xiàn)嚴(yán)重和急性炎癥反應(yīng)，是一種嚴(yán)重的膿毒性并發(fā)癥，可導(dǎo)致非心源性肺水腫、缺氧甚至死亡［1］。目前，針對ALI的有效治療仍然極為有限。為了更好地治療ALI，亟需進(jìn)一步闡明其發(fā)病機制。鐵死亡是一種新的可調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡形式，它是由于細(xì)胞內(nèi)鐵依賴性脂質(zhì)活性氧物質(zhì)的過度積累而發(fā)生的［2］。與細(xì)胞凋亡、壞死和細(xì)胞焦亡等其他細(xì)胞死亡途徑相比，鐵死亡不具有細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征或現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為脂質(zhì)活性氧和鐵的積累，線粒體顯著收縮，膜密度增加［3］。因此，檢測活性氧、鐵和谷胱甘肽含量是鑒別鐵死亡的三個有效金標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。近年來，在許多肺部疾病中都顯示了鐵死亡，包括肺纖維化、肺癌和急性肺損傷［4-5］。然而，尚未確定鐵死亡是否參與ALI的過程。鐵死亡的發(fā)生主要是由于谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）失活導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累，從而驅(qū)動細(xì)胞死亡［6］。因此，GPX4可能作為一個關(guān)鍵的調(diào)控因素發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究分析了在體外LPS刺激小鼠肺上皮細(xì)胞系（MLE-12）以及體內(nèi)小鼠膿毒癥模型誘導(dǎo)的ALI過程中鐵死亡的作用，并探討GPX4在這一過程的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1　細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠肺上皮細(xì)胞系MLE-12（獲自ATCC）維持在含10%胎牛血清（fetal bovine serurn， FBS）和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液（GIBCO）中，并置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2　動物

48只SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠（體重18～22 g）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證編號為SCXK（京）20190010。小鼠飼養(yǎng)在SPF條件下（控制溫度和濕度，12 h明暗循環(huán)），并提供足夠的新鮮食物和飲用水。

3　試劑

鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）購自MedChemExpress；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和RIPA裂解緩沖液試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯（dichloro dihydro fluorescein diacetate， DCFH-DA）購自Sigma-Aldrich；FeRhonox-1鐵離子（Ⅱ）活細(xì)胞成像探針購自Goryo；丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）和BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自南京建城生物工程研究所；聚偏二氟乙烯膜購自Millipore；抗GPX4兔抗體和抗Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（Wilms tumor 1-associated protein， WTAP）兔抗體購自Bioworld Technology；抗GAPDH抗體購自Proteintech；山羊抗兔Ⅱ抗購自武漢三鷹生物科技有限公司；Alexa Fluor 488抗山羊Ⅱ抗或Alexa Fluor 594抗兔Ⅱ抗購自Abcam；鐵測定試劑盒購自Abcam。

酶標(biāo)儀購自BioTek；激光共聚焦顯微鏡購自Leica；流式細(xì)胞術(shù)購自BD Biosciences；加熱墊購自Physitemp Instruments。

4　方法

4.1細(xì)胞處理實驗1考察脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）暴露對MLE-12細(xì)胞鐵死亡的影響，用終濃度為2 mg/L的LPS分別處理MLE-12細(xì)胞2、6和12 h。同時將接種于完全培養(yǎng)液并無LPS培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組。實驗2驗證鐵死亡參與LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞分為：對照組、Fer-1組、LPS組和LPS+Fer-1組。將細(xì)胞暴露在2 mg/L的LPS中6 h作為LPS組，LPS+Fer-1組在LPS暴露前用10 μmol/L Fer-1處理2 h。實驗3考察GPX4對LPS刺激誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞損傷的影響，將細(xì)胞分為：載體組和GPX4組，載體組和GPX4組細(xì)胞在LPS暴露前用Lipofectamine 2000將載體或GPX4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，然后暴露在2 mg/L的LPS中6 h。實驗4考察WTAP對GPX4驅(qū)動的鐵死亡影響，將細(xì)胞分為：si-WTAP+si-NC組和si-WTAP+si-GPX4組，兩組細(xì)胞在LPS暴露前分別用Lipofectamine 2000將敲低（si-WTAP）、敲低（si-GPX4）和相應(yīng)對照（si-NC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，然后暴露在2 mg/L的LPS中6 h。

4.2質(zhì)粒構(gòu)建和寡核苷酸轉(zhuǎn)染為了建立GPX4穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系，將GPX4 cDNA序列克隆到從Hanbio Biotech公司獲得的pHBLV-CMV-crRNA質(zhì)粒慢病毒載體中。然后用嘌呤霉素（2 mg/L）選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。WTAP特異性siRNA（si-WTAP）、GPX4特異性siRNA（si-GPX4）及其對照（si-NC）由GenePharma設(shè)計和合成。

4.3細(xì)胞活力測定通過使用Cell Counting Kit-8 （CCK-8）試劑盒測量細(xì)胞活力。細(xì)胞以每孔1×104的密度接種在96孔板中。用PBS洗滌細(xì)胞后，將CCK-8溶液以1∶10的稀釋度添加到培養(yǎng)液中，并在37 ℃下孵育2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度（）值。

4.4活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的測定使用DCFH-DA測定MLE-12細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞以1×108/L的密度接種在共聚焦培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)過夜。小心吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA。隨后，將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。用PBS洗滌3次后，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica）觀察熒光強度。

4.5細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平的測量使用FeRhonox-1鐵離子（Ⅱ）活細(xì)胞成像探針測定細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）的水平。將細(xì)胞以1×108/L的密度接種在共聚焦培養(yǎng)皿中。處理結(jié)束后，先用PBS清洗細(xì)胞，然后用FeRhonox-1探針（4 μmol/L）在黑暗中37 ℃孵育30 min。然后，用PBS洗滌并再孵育30 min。進(jìn)入細(xì)胞的FeRhonox-1保留在細(xì)胞內(nèi)與鐵離子結(jié)合產(chǎn)生強熒光。通過激光共聚焦顯微鏡測量熒光強度以反映細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的變化。

4.6細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測定細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞以1×108/L的密度接種在培養(yǎng)皿中。處理后，洗滌細(xì)胞，然后在室溫下與工作溶液在黑暗中孵育20 min，并通過流式細(xì)胞術(shù)測量細(xì)胞凋亡。

4.7Western blot分析將處理后細(xì)胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，使用RIPA裂解緩沖液試劑盒提取蛋白質(zhì)細(xì)胞。將細(xì)胞用PBS洗滌，并與RIPA在冰上孵育30 min，然后將混合物在4 ℃下以12 000×離心5～10 min。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。將蛋白質(zhì)加載到6%～15% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃的振蕩器中與Ⅰ抗一起孵育16 h。洗膜3次后，Ⅱ抗室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行可視化。使用ImageJ軟件量化蛋白質(zhì)條帶的灰色強度。

4.8免疫熒光分析將細(xì)胞以1×108/L的密度接種在共聚焦培養(yǎng)皿中。不同處理后，用PBS清洗細(xì)胞，在4 ℃下與GPX4（1∶100）和WTAP（1∶100）Ⅰ抗溶液中孵育過夜。次日，在室溫下用Alexa Fluor 488抗山羊Ⅱ抗或Alexa Fluor 594抗兔Ⅱ抗孵育1 h。最后，將切片與DAPI孵育10 min后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

4.9小鼠分組處理將小鼠隨機分為四組：對照組、假手術(shù)組、盲腸結(jié)扎和穿刺（cecal ligation and puncture，CLP，膿毒癥模型）12 h組和CLP 24 h組，每組12只。CLP 12 h組和CLP 24 h組參照文獻(xiàn)方法建立CLP模型以誘發(fā)膿毒癥［7］。具體操作為：在用2%異氟醚麻醉的情況下，將動物置于37 ℃加熱墊上。皮膚消毒后，在腹部中線切開1 cm，暴露盲腸。盲腸在遠(yuǎn)端和盲腸基部之間的中間結(jié)扎以誘導(dǎo)中度膿毒癥。在結(jié)扎部位和盲腸尖端之間用一根21 G的針刺穿整個盲腸。少量糞便通過穿刺部位擠出。將盲腸放回腹部，用無菌6-0絲線縫合腹膜、筋膜和腹部肌肉組織。皮膚用金屬夾閉合。用0.25%布比卡因浸潤至手術(shù)部位。手術(shù)后再次進(jìn)行皮膚消毒。對于接受手術(shù)的動物，皮下注射50 mL/kg生理鹽水。假手術(shù)組的動物接受相同的手術(shù)程序但沒有進(jìn)行CLP。對照組不做任何手術(shù)。在手術(shù)結(jié)束時處死小鼠，收集肺葉和動脈血用于進(jìn)一步分析。其中每組6只進(jìn)行組織學(xué)評估，另外6只用于體內(nèi)鐵、MDA和GSH的測定。在肺勻漿的研究中，肺在收獲前用4 ℃ PBS通過上腔靜脈與左心房切口進(jìn)行灌注。

4.10組織學(xué)評估將肺組織固定在4%多聚甲醛溶液中。在5 μm石蠟包埋的組織載玻片上進(jìn)行蘇木精和伊紅 （H&E）。H&E染色切片通過對3個隨機視野的評分進(jìn)行平均來計算肺損傷評分。使用的評分標(biāo)準(zhǔn)包括炎癥浸潤、肺泡水腫、間質(zhì)水腫和出血［8］。0到3的評分表示如下：0=無損傷，1=輕度損傷，2=中度損傷，3=極度傷害。還使用以下評分計算每個部位的受傷面積：缺席（0）、小于1/4（1）、1/4-1/2（2）、1/2-3/4（3）及超過3/4（4）。最終肺損傷評分范圍為0～12。

4.11體內(nèi)鐵、MDA和GSH的測定通過使用試劑盒測定肺勻漿中的MDA和GSH水平，以反映體內(nèi)肺組織脂質(zhì)過氧化的程度。使用鐵測定試劑盒通過顯色法測量肺組織中鐵含量。

5　統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均以至少3個獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式呈現(xiàn)。使用Student's檢驗（雙尾）或單因素方差分析檢驗分析實驗結(jié)果。<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　LPS暴露誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞鐵死亡

MLE-12細(xì)胞分別用LPS處理2、6和12 h。結(jié)果表明，LPS暴露改變了MLE-12細(xì)胞的形態(tài)（圖1A），并以時間依賴性方式降低了細(xì)胞活力（<0.05或<0.01，圖1B）。流式細(xì)胞儀檢測死亡的結(jié)果還顯示，隨著LPS暴露時間的延長，細(xì)胞死亡的比例增加（<0.05或<0.01，圖1C）。此外，與對照組相比，隨著LPS暴露時間的延長細(xì)胞中ROS水平和Fe2+水平增加，而鐵死亡標(biāo)志物GPX4的蛋白表達(dá)逐漸降低（圖1D～F）?；谝陨蠈嶒?，本研究選擇LPS刺激6 h作為后續(xù)實驗條件。

Figure 1.　LPS exposure induced ferroptosis of MLE-12 cells. MLE-12 cells were exposed to LPS for different time. A： cell morphology image， with the prolongation of LPS exposure time， the cell morphology changed significantly （scale bar=20 μm）； B： the cell viability decreased with the prolongation of LPS exposure time； C： apoptosis and quantitative results were analyzed using Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry， and apoptosis increased with prolonged LPS exposure； D： DCFH-DA was used to measure the intracellular ROS levels， and ROS levels increased with prolonged exposure to LPS； E： fluorescent probe was used to measure the intracellular Fe2+ level， and Fe2+ levels increased with prolonged exposure to LPS； F： Western blot was used to measure the GPX4 expression levels. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

2　鐵死亡參與LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡

用終濃度為5、10、20、30 和40 μmol/L的Fer-1處理MLE-12細(xì)胞24 h。由于10 μmol/L Fer-1的濃度對細(xì)胞活力沒有顯著影響，因此后續(xù)實驗采用10 μmol/L Fer-1作為研究濃度（圖2A）。如圖2B～E所示，相對于LPS組，在LPS+Fer-1組中細(xì)胞活力顯著增加（<0.05），細(xì)胞凋亡百分率、ROS水平和Fe2+水平顯著降低（<0.05）。

Figure 2.　Inhibition of ferroptosis attenuated LPS-induced injury in MLE-12 cells. A and B： CCK-8 assay was used to detected the cell viability； C： apoptosis and quantitative results were analyzed using Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry； D： DCFH-DA was used to measure the intracellular ROS levels； E： fluorescent probe was used to measure the intracellular Fe2+ level. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05 vs LPS group.

3　GPX4過表達(dá)減弱LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞損傷

如圖3A所示，與載體組相比，GPX4組細(xì)胞中GPX4表達(dá)顯著增加。相對于載體組，GPX4組中細(xì)胞活力顯著增加（<0.05），細(xì)胞凋亡百分比、ROS水平和Fe2+水平顯著降低（<0.05或<0.01），見圖3B～E。

Figure 3.　GPX4 activation attenuated LPS-induced injury in MLE-12 cells. A： Western blot was used to measure the GPX4 expression levels； B： CCK-8 assay was used to detected the cell viability， and GPX4 increased cell viability； C： apoptosis and quantitative results were analyzed using Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry， and GPX4 reduced apoptosis； D： DCFH-DA was used to measure the intracellular ROS levels， and GPX4 reduced ROS levels； E： fluorescent probe to measure intracellular Fe2+ level， and GPX4 reduced Fe2+ level. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vector group.

4　LPS對MLE-12細(xì)胞GPX4 m6A修飾的影響

與對照組相比，隨著LPS暴露時間的延長，細(xì)胞中WTAP蛋白水平以及WTAP/GPX4比例顯著增加，GPX4蛋白水平顯著降低（圖4）。

Figure 4.　The effect of LPS on the modification of GPX4 m6A in MLE-12 cells. A： Western blot was used to measure the WTAP expression levels， and WTAP expression levels decreased with prolonged exposure to LPS； B： immunofluorescence detection and quantitative analysis of WTAP and GPX4 in MLE-12 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

5　WTAP介導(dǎo)GPX4驅(qū)動的鐵死亡

通過Western blot驗證了WTAP siRNA和GPX4 siRNA的敲低效率（圖5A、B）。與si-WTAP+si-NC組相比，si-WTAP+si-GPX4組MLE-12細(xì)胞中ROS水平和Fe2+水平顯著增加（<0.05），見圖5C、D。

Figure 5.　WTAP mediated GPX4-driven ferroptosis. A and B： WTAP and GPX4 expression levels were analyzed by Western blot； C： DCFH-DA was used to the measure intracellular ROS levels； D： fluorescent probe was used to measure the intracellular Fe2+ level. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs si-WTAP+si-NC group.

6　CLP誘導(dǎo)的ALI增強肺組織鐵死亡

與假手術(shù)組相比，CLP 12 h組和CLP 24 h組小鼠肺組織學(xué)評分顯著升高（<0.05或<0.01），見圖6A。鐵損傷標(biāo)志物分析顯示，CLP 12 h組和CLP 24 h組小鼠肺勻漿中鐵含量和MDA水平顯著增加（<0.05或<0.01），GSH水平顯著降低（<0.05或<0.01），見圖6B～D。此外，CLP 12 h組和CLP 24 h組小鼠肺組織中GPX4蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低（<0.05或<0.01），WTAP蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（<0.05），見圖6E。

Figure 6.　CLP-induced ALI enhanced ferroptosis in lung tissue. A： CLP-related lung injury was determined by hematoxylin and eosin staining （scale bar=100 μm）； B to D： iron content （B）， MDA （C） and total GSH （D） levels in lung homogenates； E： the expression levels of GPX4 and WTAP in lung tissue were analyzed by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs control group.

討論

膿毒癥仍然是重癥監(jiān)護病房死亡的主要原因，這被視為一個重大的全球健康挑戰(zhàn)［9-10］。肺是膿毒癥損傷的第一個重要器官，導(dǎo)致ALI并導(dǎo)致膿毒癥引起的死亡［8］。然而，從未探索鐵死亡是否以及如何在ALI中發(fā)揮作用。在這項研究中，我們證明了LPS暴露直接增加了細(xì)胞內(nèi)ROS和Fe2+水平，降低了GPX4表達(dá)并導(dǎo)致MLE-12細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明，鐵死亡是膿毒癥誘發(fā)ALI的關(guān)鍵因素。

鐵死亡是一種鐵依賴性、非凋亡形式的細(xì)胞死亡，其特征是細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，在形態(tài)學(xué)、生化和遺傳上與自噬、細(xì)胞凋亡和壞死不同［11］。雖然尚未確定鐵死亡的生理功能，但已確定其在人類疾病中的作用。鐵死亡已成為一種新形式的受調(diào)節(jié)壞死，與各種人類疾病有關(guān)。在這項研究中，我們觀察到鐵死亡參與了CLP誘導(dǎo)的ALI，與之前的研究結(jié)果一致［12-13］，這些研究表明，鐵死亡與人類疾病的發(fā)病機制有關(guān)。此外，據(jù)報道，鐵死亡與膿毒癥誘導(dǎo)的器官損傷有關(guān)，在多個實驗?zāi)Ｐ椭校种畦F死亡已被證明可有效治療CLP誘導(dǎo)的器官損傷［14-15］。在這項研究中，我們觀察到LPS暴露會誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞損傷和死亡，而通過Fer-1抑制鐵死亡可以改善細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡。此外，F(xiàn)er-1處理降低了細(xì)胞內(nèi)ROS和Fe2+水平。這些結(jié)果表明，鐵死亡參與了LPS暴露引起的MLE-12細(xì)胞損傷。

闡明鐵死亡如何引發(fā)ALI將為治療這些疾病提供新的治療機會。GPX4是一類抗氧化酶的成員。作為谷胱甘肽的底物，GPX4能夠?qū)2O2和脂質(zhì)ROS分別降解為水和相應(yīng)的醇，從而降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)H2O2水平，避免對細(xì)胞的氧化損傷，在細(xì)胞存活中起著至關(guān)重要的作用［16］。越來越多的研究證實GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵和中心調(diào)節(jié)因子［17］。例如，敲除會導(dǎo)致與鐵死亡相關(guān)的細(xì)胞死亡和急性腎功能衰竭［18］；GPX4低表達(dá)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加，從而通過增強轉(zhuǎn)化生長因子β信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)肺纖維化［9］。在本研究中，GPX4的表達(dá)在LPS暴露誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞中和CLP小鼠模型肺組織中下調(diào)。此外，通過過表達(dá)MLE-12細(xì)胞中GPX4顯著減弱了由LPS暴露引起的ROS和Fe2+水平增加，進(jìn)而減輕MLE-12細(xì)胞損傷。

m6A甲基化是RNA表觀遺傳修飾的一種常見形式，通過RNA翻譯和降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而潛在地調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生和進(jìn)展［19］，這一生物學(xué)過程涉及三種催化酶，即“書寫”甲基轉(zhuǎn)移酶、“擦除”去甲基化酶和“閱讀”甲基化閱讀蛋白［20］。在這些酶中，甲基轉(zhuǎn)移酶是由METTL3和METTL14組成的復(fù)合物，形成異二聚體催化核心并調(diào)節(jié)亞基WTAP，共同促進(jìn)甲基化反應(yīng)［20］。以往對m6A的研究主要集中在胚胎發(fā)育異常和腫瘤方面［20］。近年來，越來越多的研究人員關(guān)注m6A在肺部疾病中的作用，包括肺纖維化和肺癌，并顯示m6A在在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［21-22］。本研究中，LPS暴露導(dǎo)致MLE-12細(xì)胞中WTAP蛋白水平以及WTAP/GPX4比例顯著增加，并且在CLP小鼠肺組織中也觀察到GPX4蛋白表達(dá)降低和WTAP蛋白表達(dá)升高。這些數(shù)據(jù)表明WTAP介導(dǎo)的m6A修飾可能是GPX4的上游目標(biāo)，并參與調(diào)節(jié)GPX4介導(dǎo)的鐵死亡。

總之，本研究證明了GPX4可抑制鐵死亡并減輕LPS引起的ALI。這闡明了膿毒癥引起肺損傷的新機制，并將GPX4確定為治療ALI的潛在治療靶點。

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Regulatory role of GPX4 m6A modification in ferroptosis of lung epithelial cells in mice with sepsis-induced acute lung injury

LIU Hong-ying1， DING Lu1， WANG Hui1， FAN Guang-pu2△

（1，2，，100044，）

To analyze the role of ferroptosis in the apoptosis of mouse lung epithelial cell line MLE-12 and acute lung injury （ALI） in mice induced by sepsis， and to explore the regulatory role of glutathione peroxidase 4 （GPX4） in these processes.Forexperiment 1， the MLE-12 cells were divided into control group， ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 （Fer-1） group， lipopolysaccharide （LPS） group and LPS+Fer-1 group to investigate the participation of ferroptosis in LPS-induced MLE-12 cell apoptosis. For experiment 2， the cells were divided into vector group and GPX4 group to investigate the effect of GPX4 on MLE-12 cell damage induced by LPS stimulation. For experiment 3， the cells were divided into si-WTAP （Wilms tumor 1-associated protein）+si-NC group and si-WTAP+si-GPX4 group to investigate the effect of WTAP on GPX4-driven ferroptosis. The MLE-12 cells were stimulated by LPS to build anmodel， and then the cells were treated with Fer-1 or transfected with GPX4 overexpression plasmid （GPX4）， WTAP-specific siRNA （si-WTAP） and GPX4-specific siRNA （si-GPX4）. Cell viability was determined by CCK-8 assay， apoptosis was analyzed by flow cytometry， intracellular reactive oxygen species （ROS） levels were determined by DCFH-DA， intracellular Fe2+levels were determined by fluorescent probes， and GPX4 and WTAP expression levels were analyzed by Western blot. Forexperiments， C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups： control group， sham surgery group， cecal ligation and puncture （CLP） 12 h group， and CLP 24 h group， with 12 individuals in each group. HE staining was performed to assess lung damage in mice， and the iron， malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） levels in lung homogenates were measured using the kit method.Compared with control group， GPX4， the marker of ferroptosis， was decreased gradually， and the protein level of WTAP and WTAP/GPX4 ratio were increased significantly with the prolonged LPS exposure time （<0.05）. Compared with LPS group， cell viability was significantly increased in LPS+Fer-1 group （<0.05）， and the percentage of apoptosis， ROS level and Fe2+level were significantly reduced （<0.05）. Compared with vector group， GPX4 expression and cell viability were significantly increased in GPX4 group （<0.05）， and the percentage of apoptosis， ROS level and Fe2+level were significantly reduced （<0.05）. Compared with si-WTAP+si-NC group， the ROS and Fe2+levels in si-WTAP+si-GPX4 group were significantly increased （<0.05）. Compared with sham surgery group， the lung histological score and iron content， MDA level， and WTAP in the lung homogenate were significantly increased in CLP 12 h group and CLP 24 h group （<0.05）， and the expression of GPX4 protein and GSH in lung tissue were significantly reduced （<0.05）.The m6A modification mediated by WTAP may be an upstream target for GPX4 and promote sepsis-induced MLE-12 cell apoptosis and ferroptosis in the ALI process in mice by lowering GPX4 levels.

Sepsis； Acute lung injury； Lung epithelial cells； Ferroptosis； Glutathione peroxidase 4

1000-4718（2022）09-1659-08

2022-02-28

2022-07-11

13911806511； E-mail： liuhogying02@163.com

R631.+2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.016

［基金項目］北京市衛(wèi)生健康科研基金項目（No. 20200081）

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）