趙青青， 余云艷， 王云， 何維， 楊艷，4， 陳銳， 楊小理，4△， 程曉明△

LASS2誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌8505c細(xì)胞自噬、凋亡及相關(guān)機(jī)制的探討*

趙青青1， 余云艷2， 王云1， 何維3， 楊艷3，4， 陳銳1， 楊小理3，4△， 程曉明1△

（1遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，2遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，3遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，4遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000）

研究LAG1長(zhǎng)壽保障同系物2（LASS2）對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞株8505c凋亡及自噬的影響及可能的分子機(jī)制。用Adv-GFP或Adv-LASS2-GFP重組腺病毒感染8505c細(xì)胞，細(xì)胞分為陰性對(duì)照（NC）組、空載體組（Adv-GFP組）和實(shí)驗(yàn)組（Adv-LASS2-GFP組）。感染48 h后提取各組細(xì)胞總RNA和蛋白，采用RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)LASS2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞增殖能力的差異；TUNEL染色評(píng)估各組細(xì)胞凋亡水平；透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬狀態(tài)；Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白［細(xì)胞色素C（Cyto-C）、Bcl-2、Bax、p62、LC3-I、LC3-II和beclin-1］的表達(dá)水平；免疫共沉淀（Co-IP）聯(lián)合液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）鑒定與LASS2相互作用的蛋白，結(jié)合基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)等分析并經(jīng)Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證互作關(guān)系。與NC組和Adv-GFP組相比，Adv-LASS2-GFP組LASS2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（<0.01），且隨時(shí)間延長(zhǎng)Adv-LASS2-GFP組細(xì)胞增殖能力顯著被抑制，集落形成能力降低，細(xì)胞凋亡增加（<0.01）；透射電鏡結(jié)果顯示，與NC組和Adv-GFP組相比，Adv-LASS2-GFP組細(xì)胞可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及大量自噬溶酶體；Western blot結(jié)果顯示，Adv-LASS2-GFP組Bcl-2和p62蛋白表達(dá)水平較NC組和Adv-GFP組均顯著下調(diào)（<0.01），Bax、Cyto-C和beclin-1表達(dá)及LC3-II/LC3-I比值均顯著上調(diào)（<0.01）；Co-IP/LC-MS鑒定及GO等富集分析篩選出參與調(diào)控自噬信號(hào)通路且與LASS2相互作用的4個(gè)蛋白，分別為p62、HSC70、HSP90和CSNK2A1。Co-IP結(jié)果顯示LASS2與p62不存在直接相互作用。LASS2能促進(jìn)8505c細(xì)胞凋亡并激活自噬，其作用機(jī)制可能是通過(guò)與p62/HSC70/HSP90/CSNK2A1相互作用而影響自噬和凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。

LAG1長(zhǎng)壽保障同系物2；甲狀腺未分化癌；自噬；細(xì)胞凋亡

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma， ATC）是甲狀腺癌（thyroid carcinoma， TC）中一種罕見(jiàn)的、高侵襲性的惡性腫瘤，盡管其發(fā)病率僅占1%～3%，但其中位生存期低于6個(gè)月，其死亡病例占所有TC中死亡病例的14%～39%［1］。由于其無(wú)放射性碘攝取、促甲狀腺激素合成及甲狀腺球蛋白合成的生物學(xué)功能，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的治療方案［2］，常規(guī)治療收效甚微。因此，關(guān)注ATC相關(guān)分子生物學(xué)如相關(guān)癌基因、抑癌基因等分子機(jī)制的深入研究有望為ATC的靶向治療提供潛在治療靶點(diǎn)。

研究表明，LAG1長(zhǎng)壽保障同系物2（LAG1 longevity assurance homolog 2， LASS2）對(duì)肝癌［3］、乳腺癌［4］、膀胱癌［5-6］、前列腺癌［7］等惡性腫瘤的浸潤(rùn)和生長(zhǎng)具有抑制作用，因此又被稱(chēng)為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1（tumor metastasis suppressor gene-1， TMSG-1）；它主要調(diào)節(jié)長(zhǎng)?；溕窠?jīng)酰胺合成，而神經(jīng)酰胺作為脂質(zhì)第二信使，參與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、分化和凋亡等過(guò)程。另有研究報(bào)道，LASS2能促進(jìn)神經(jīng)酰胺合成誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞自噬［8］。自噬是溶酶體介導(dǎo)降解細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器、未折疊蛋白質(zhì)等細(xì)胞代謝產(chǎn)物的生物進(jìn)程［9］，與凋亡之間能被多種應(yīng)激刺激共同激活、共享多個(gè)調(diào)節(jié)因子，甚至互相協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)換［10］，靶向凋亡和/或毒性自噬可促進(jìn)臨床前治療選擇的發(fā)展［11］。本課題組前期研究表明，與癌旁正常組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織相比，LASS2在乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma， PTC）中表達(dá)降低，并與PTC的臨床分期有關(guān)，過(guò)表達(dá)LASS2可抑制人PTC細(xì)胞系BCPAP的增殖，促進(jìn)凋亡并導(dǎo)致G0/G1期阻滯［12］。然而，TC有多種病理分型，LASS2在其它病理分型尤其是ATC中對(duì)凋亡和自噬的作用及可能機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本項(xiàng)工作以人ATC細(xì)胞系8505c作為研究對(duì)象，體外觀察LASS2對(duì)8505c細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響，并探討其相關(guān)分子機(jī)制，為ATC的分子靶向治療提供參考資料。

材料和方法

1　細(xì)胞

8505c細(xì)胞購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司，采用含10%胎牛血清（fetal calfserum， FBS）的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，液氮保存。

2　主要試劑與儀器

Adv-GFP和Adv-LASS2-GFP重組腺病毒購(gòu)自北京百奧川生物科技有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)液和FBS購(gòu)自Gibco；Trizol和RT-qPCR試劑購(gòu)自TaKaRa；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyto-C）單克隆抗體和兔抗p62單克隆抗體均購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；兔抗beclin-1單克隆抗體和兔抗LC3（LC3-I和LC3-II）單克隆抗體均購(gòu)自CST；鼠抗LASS2單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和免洗考馬斯亮藍(lán)染液購(gòu)自上海雅酶生物科技公司；IP裂解/洗滌緩沖液購(gòu)自Thermo Fisher；GFP納米抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠購(gòu)自成都阿帕克生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。HITACHI 7800透射電子顯微鏡購(gòu)自HITACHI；CFX96 Real-Time PCR儀和ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自Bio-Rad。

3　主要方法

3.1細(xì)胞感染及實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞傳至第4代且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用Adv-GFP和Adv-LASS2-GFP分別感染8505c細(xì)胞，分成陰性對(duì)照（negative control， NC）組、空載體組（Adv-GFP組）和實(shí)驗(yàn)組（Adv-LASS2-GFP組），感染48 h后按各實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行收樣。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.2RT-qPCR檢測(cè)LASS2 mRNA表達(dá)情況感染48 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，儲(chǔ)存于-80 ℃ 冰箱中備用。以β-actin作為內(nèi)參照，RT-qPCR檢測(cè)分析LASS2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，擴(kuò)增體系25 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2-ΔΔCt值表示基因相對(duì)表達(dá)量。β-actin的上游引物序列為5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物序列為5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'；LASS2的上游引物序列為5'-ATCGTCTTC GCCATTGTT-3'，下游引物序列為5'-CGGTCACTGCGTTCATCT-3'。

3.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力收集各組8505c細(xì)胞，調(diào)整濃度至2.5×107/L，以每孔100 μL的量接種至96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，次日感染Adv-GFP或Adv-LASS2-GFP，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，各時(shí)間點(diǎn)棄舊培養(yǎng)液，加入100 μL DMEM及10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各組值并制作生長(zhǎng)曲線［13］。

3.4TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡嚴(yán)格按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。收集細(xì)胞，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，制備細(xì)胞涂片。0.3% PBS稀釋的Triton X-100室溫孵育樣品5 min透化，PBS洗3次，每次5 min。在樣品上分別加入適當(dāng)濃度的TUNEL檢測(cè)液37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察8505c細(xì)胞形態(tài)變化和TUNEL陽(yáng)性顆粒［14］。采用ImageJ軟件計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

3.5Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白的相對(duì)表達(dá)水平感染48 h后，按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，經(jīng)蛋白變性、分裝并暫存于-80 ℃。每個(gè)泳道上樣量為20 μg，10%或12.5% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4 ℃濕轉(zhuǎn)、封閉、洗膜、Ⅰ抗（鼠抗LASS2單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶500，鼠抗β-actin單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶5 000，兔抗Bcl-2、Bax、p62、beclin-1、LC3和GFP單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜、洗膜、Ⅱ抗（羊抗鼠、羊抗兔Ⅱ抗稀釋倍數(shù)均為1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜、成像，Gel-Pro軟件測(cè)量條帶灰度值并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算LASS2、Bcl-2、Bax、p62、beclin-1、LC3和Cyto-C蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3.6透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化感染48 h后，去除培養(yǎng)液、用滅菌PBS輕柔漂洗細(xì)胞2次，以500×離心3 min收集各組細(xì)胞，分別加入2.5%戊二醛4 ℃固定、丙酮逐級(jí)脫水、包埋、切片及枸櫞酸鉛染色后，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化并拍片［15］。

3.7Co-IP/LC-MS鑒定與LASS2互作的蛋白及互作網(wǎng)絡(luò)的建立與驗(yàn)證將各組8505c細(xì)胞用預(yù)冷的IP裂解/洗滌緩沖液裂解5 min、離心、取上清（總蛋白）并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將25 μL已平衡的GFP納米抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠加入1 mg總蛋白中，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育60 min、4 ℃離心棄上清、預(yù)冷的IP裂解/洗滌緩沖液重懸、離心棄上清、加入2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液重懸、95 ℃煮沸10 min，再次離心、沉淀GFP納米抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠并吸取上清（即為與LASS2互作的免疫復(fù)合物）。制膠、上樣、用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離復(fù)合物，清洗去除雜質(zhì)、加入免洗脫考馬斯亮藍(lán)染液染色并清洗、觀察并拍照；將上述制備好的膠條經(jīng)蛋白酶解、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）檢測(cè)并鑒定與LASS2互作的免疫復(fù)合物，并行GO分析、直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（cluster of orthologous group， COG）、真核生物同源蛋白簇（eukaryotic orthologous groups， KOG）功能注釋、信號(hào)通路（pathway）功能注釋及STRING篩選、建立與LASS2互作自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)，采用Co-IP首先驗(yàn)證該網(wǎng)絡(luò)中p62與LASS2互作關(guān)系。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析， Graph Pad Prism 8.0作圖。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間差異比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　LASS2在8505c細(xì)胞中過(guò)表達(dá)

Adv-LASS2-GFP組LASS2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別較NC組和Adv-GFP組均顯著上調(diào)（<0.01），NC組與Adv-GFP組未見(jiàn)顯著差異（0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.　Validation of LASS2 overexpression in 8505c cells. A： overexpression of LASS2 showed green fluorescence （scale bar=200 μm）； B： relative mRNA expression of LASS2 in 8505c cells assessed by RT-qPCR； C： the protein expression of LASS2 in 8505c cells assessed by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Adv-GFP group.

2　過(guò)表達(dá)LASS2對(duì)8505c細(xì)胞增殖及集落形成能力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與NC組和Adv-GFP組相比，Adv-LASS2-GFP組在轉(zhuǎn)染48和72 h后，過(guò)表達(dá)的LASS2顯著抑制8505c細(xì)胞增殖（<0.01），而NC組與Adv-GFP組之間無(wú)顯著差異（>0.05），見(jiàn)圖2A。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Adv-LASS2-GFP組集落形成率較NC組和Adv-GFP組顯著降低（<0.01），見(jiàn)圖2B。

Figure 2.　Effect of LASS2 overexpression on the proliferation and colony formation of 8505c cells. A： the viability of 8505c cells detected by CCK-8 assay； B： the colony formation assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Adv-GFP group.

3　過(guò)表達(dá)LASS2對(duì)8505c細(xì)胞凋亡能力的影響

使用TUNEL染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞，TUNEL標(biāo)記中紅色熒光為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果顯示，與NC組和Adv-GFP組相比，Adv-LASS2-GFP組細(xì)胞紅色熒光顯著增多（<0.01），見(jiàn)圖3。

Figure 3.　Effect of LASS2 overexpression on the apoptosis of 8505c cells detected by TUNEL staining （scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Adv-GFP group.

4　過(guò)表達(dá)LASS2對(duì)8505c細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC組和Adv-GFP組相比，Adv-LASS2-GFP組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax和Cyto-C蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01），而NC組與Adv-GFP組之間無(wú)顯著差異（>0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.　Effect of LASS2 overexpression on the expression of apoptosis-related proteins Cyto-C，Bax and Bcl-2 in 8505c cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Adv-GFPgroup.

5　透射電鏡觀察過(guò)表達(dá)LASS2對(duì)8505c細(xì)胞自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，與NC組和Adv-GFP組比較，Adv-LASS2-GFP組可見(jiàn)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.　Effect of LASS2 overexpression on the autophagy of 8505c cells was observed under transmission electron microscope. Scale bar=1 μm.

6　過(guò)表達(dá)LASS2對(duì)8505c細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3和p62表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，Adv-LASS2-GFP組p62蛋白表達(dá)水平顯著低于NC和Adv-GFP組（<0.01），而beclin-1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I比值相對(duì)NC和Adv-GFP組顯著上調(diào)（<0.01），見(jiàn)圖6。

Figure 6.　Effect of LASS2 overexpression on the protein expression of LC3， beclin-1 and p62 in 8505c cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Adv-GFP group.

7　LASS2通過(guò)與p62/HSC70/HSP90/CSNK2A1互作而激活自噬

為了進(jìn)一步探討過(guò)表達(dá)的LASS2對(duì)8505c細(xì)胞自噬和凋亡作用的相關(guān)機(jī)制，我們采用Co-IP/LC-MS鑒定與LASS2互作的蛋白并通過(guò)GO富集分析、STRING等，篩選與LASS2互作的凋亡和自噬相關(guān)關(guān)鍵蛋白并建立互作網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果提示，LASS2與p62/HSC70 （heat shock cognate protein 70）/HSP90 （heat shock protein 90）/CSNK2A1 （casein kinase 2 alpha 1）存在直接或間接互作關(guān)系。Co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證LASS2與p62是否存在互作關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LASS2與p62之間不存在直接互作關(guān)系。見(jiàn)圖7。

Figure 7.　Isolation of LASS2 protein complex and validation of interaction between LASS2 and p62. A： LASS2 protein complex was isolated by Co-IP SDS-PAGE and stained with Coomassie bright blue； B： the interaction network of LASS2 was constructed by STRING software based on the identification results of Co-IP/LC-MS （SQSTM1： p62； HSPA8： HSC70； HSP90AA1： HSP90）； C： the interaction between LASS2 and p62 was verified by Co-IP.

討論

治療或干預(yù)后腫瘤細(xì)胞存活或死亡的分子機(jī)制是復(fù)雜的，細(xì)胞死亡過(guò)程大致分為細(xì)胞凋亡、自噬性細(xì)胞死亡和壞死，其中細(xì)胞凋亡可能是最廣泛的特征形式程序性或調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡［16］，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤防治的手段之一。細(xì)胞凋亡是多基因精確調(diào)控、由經(jīng)典的內(nèi)源性和外源性凋亡途徑執(zhí)行，其中內(nèi)源性途徑是通過(guò)激活有毒的BH3結(jié)構(gòu)域蛋白如Bax和（或）Bak來(lái)啟動(dòng)的，這些蛋白在線粒體外膜中形成孔從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，伴隨Cyto-C釋放到胞質(zhì)中［16］。Huang等［6］報(bào)道LASS2誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞（J82、BIU87）線粒體融合，抑制線粒體分裂，降低線粒體膜電位。前期研究顯示，過(guò)表達(dá)的LASS2降低HepG2細(xì)胞線粒體膜電位并引起胞內(nèi)Ca2+超載，提示其可能通過(guò)調(diào)控線粒體功能抑制肝癌的發(fā)展［3］。因此，在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了線粒體途徑相關(guān)的內(nèi)源性凋亡，結(jié)果顯示LASS2過(guò)表達(dá)抑制8505c細(xì)胞活力和集落形成能力，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Bax和Cyto-C表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，這與本課題在PTC體外前期研究［12］的結(jié)果一致，提示LASS2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抑制ATC的重要機(jī)制之一。

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、進(jìn)化上保守的重要分子途徑，在腫瘤細(xì)胞中自噬發(fā)揮雙重作用，取決于不同腫瘤的類(lèi)型、階段或遺傳背景。一方面，作為細(xì)胞質(zhì)量控制機(jī)制，防止腫瘤發(fā)生，尤其是在腫瘤發(fā)生的早期階段，即自噬可作為一種腫瘤抑制因子。另一方面，腫瘤進(jìn)展到晚期，自噬可作為腫瘤細(xì)胞存活的主要因素促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移或作為一種細(xì)胞防御機(jī)制可能降低化療藥物的治療效果。本研究結(jié)果顯示，LASS2過(guò)表達(dá)促進(jìn)8505c細(xì)胞自噬小體和大量自噬溶酶體形成，beclin-1表達(dá)水平和LC3-II/LC3-I比值升高，自噬底物蛋白p62表達(dá)水平降低，說(shuō)明胞內(nèi)自噬激活。

自噬作為一種程序性細(xì)胞死亡，與凋亡密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生過(guò)程中的多個(gè)信號(hào)通路并與凋亡存在復(fù)雜的串?dāng)_。已有研究表明，beclin-1與Bcl-2蛋白相互作用可增強(qiáng)或破壞自噬和凋亡之間的串?dāng)_［16］?；蜃允扇苊阁w釋放的組織蛋白酶可以切割有毒的BH3結(jié)構(gòu)域蛋白BID，從而將Bax和Bak從保護(hù)性BH3結(jié)構(gòu)域蛋白如Bcl-2中置換出來(lái)［10］。因此，自噬和凋亡兩者之間存在合作、促進(jìn)和對(duì)抗交互作用關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LASS2促進(jìn)8505c細(xì)胞凋亡及激活自噬，提示兩者可能互為促進(jìn)或合作關(guān)系、促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡。為進(jìn)一步明確LASS2調(diào)控自噬、凋亡的分子機(jī)制，本研究通過(guò)Co-IP/LC-MS鑒定與LASS2的互作蛋白，率先揭示LASS2與p62/HSC70/HSP90/CSNK2A1存在直接或間接互作關(guān)系。鑒于p62在細(xì)胞凋亡、自噬和腫瘤發(fā)生等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［17］，本實(shí)驗(yàn)采用Co-IP首先驗(yàn)證LASS2與p62之間的互作關(guān)系，結(jié)果顯示LASS2與p62不存在直接互作，可能存在中間蛋白介導(dǎo)兩者互作。Matsumoto等［18］觀察到CSNK2能直接磷酸化p62的Ser403，并促進(jìn)蛋白泛素化的選擇性自噬降解。Miyata等［19］表明，HSP90可誘導(dǎo)CSNK2聚集物解離，形成可溶的HSP90-CSNK2復(fù)合物，并顯著增強(qiáng)CSNK2激酶活性。本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了LASS2與p62的互作形式，有待更多、深入的研究去證明其中的互作關(guān)系。

綜上所述，LASS2可顯著誘導(dǎo)人ATC細(xì)胞系8505c凋亡和自噬，其作用機(jī)制可能是通過(guò)與p62/HSC70/HSP90/CSNK2A1互作而影響自噬和凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。

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LASS2 mediates autophagy and apoptosis of anaplastic thyroid carcinoma 8505c cells and its related mechanisms

ZHAO Qing-qing1， YU Yun-yan2， WANG Yun1， HE Wei3， YANG Yan3，4， CHEN Rui1， YANG Xiao-li3，4△， CHENG Xiao-ming1△

（1，，2，，3，，4，，563000，）

To investigate the effects of LAG1 longevity assurance homolog 2 （LASS2） on the apoptosis and autophagy of anaplastic thyroid carcinoma 8505c cells and its possible mechanisms.The 8505c cells were divided into negative control （NC） group， Adv-GFP group and Adv-LASS2-GFP group， which were not infected or infected with recombinant adenoviruses Adv-GFP or Adv-LASS2-GFP. Total RNA and protein of each group were extracted 48 h after infection. The relative LASS2 mRNA and protein expression levels were determined by RT-qPCR and Western blot， the proliferation of the cells was examined by CCK-8 and colony formation assays， and the apoptosis of the cells was examined by TUNEL staining. Cell ultrastructure and autophagy state were observed by transmission electron microscopy. The expression of apoptosis- and autophagy-related proteins， cytochrome-C （Cyto-C）， Bcl-2， Bax， p62， LC3-I， LC3-II and beclin-1， was determined by Western blot. Co-immunoprecipitation （Co-IP） combined with liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS） was used to identify the proteins interacting with LASS2. The proteins were analyzed by Gene Ontology （GO） database and further verified by Co-IP.Compared with NC and Adv-GFP groups， the relative mRNA and protein expression levels of LASS2 in Adv-LASS2-GFP group were significantly up-regulated （<0.01）， the cell apoptosis was significantly promoted （<0.01）， and the proliferation and colony formation abilities were significantly decreased （<0.01）. Transmission electron microscope results showed that double-membrane autophagosomes and a large number of autolysosomes were found in Adv-LASS2-GFP group compared with NC and Adv-GFP groups. The results of Western blot showed that， compared with NC and Adv-GFP groups， the expression level of Bcl-2 and p62 was significantly down-regulated， while the expression of Bax， Cyto-C and beclin-1， and the ratio of LC3-II/LC3-I were up-regulated in Adv-LASS2-GFP group （<0.01）. Co-IP/LC-MS identification and GO enrichment analysis screened 4 proteins involved in regulating autophagy signaling pathway and interacting with LASS2， including p62， HSC70， HSP90 and CSNK2A1. Co-IP showed that LASS2 did not directly interact with p62.LASS2 promotes apoptosis and autophagy of 8505c cells possibly through p62/HSC70/HSP90/CSNK2A1 signaling pathway.

LAG1 longevity assurance homolog 2； Anaplastic thyroid carcinoma； Autophagy； Apoptosis

1000-4718（2022）09-1577-08

2022-04-13 ［

2022-08-01

楊小理 Tel： 0851-28608154； E-mail： xiaoliyang1216zy@163.com； 程曉明 Tel： 0851-28608980； E-mail： cxm1688@ sina.com

R736.1； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.006

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81960494）；貴州省衛(wèi)健委科技項(xiàng)目（No. gzwjkj2019-1-192）；遵義市科技計(jì)劃課題項(xiàng)目［遵市科合HZ字（2019）68號(hào)］

（責(zé)任編輯：余小慧，李淑媛）