劉振亞，張 萍，訾莉莉，朱天生

（1.塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)園藝與林學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

棗系鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Zizyphus Mill.）植物[1]，其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，主要表現(xiàn)在耐鹽堿和耐干旱方面[2]。棗樹的種植可以在一定程度上改善南疆地區(qū)的生態(tài)環(huán)境，對(duì)減少揚(yáng)沙和浮沉天氣起到一定作用[3]。同時(shí)，種植棗樹的經(jīng)濟(jì)效益較高，嫁接后四年生的棗園年均收益可達(dá)1 萬元/667m2。因此，種植棗樹已經(jīng)成為南疆農(nóng)民增收的主要途徑。但是近年來?xiàng)棙淙~緣褐斑病呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為下部葉片首先葉緣出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，病斑直徑為2～4 mm，病斑常沿葉緣連在一起；果枝或棗吊頂生的2～3片新葉無癥狀，向下葉片癥狀逐漸加重，可在9 月引起葉片提前脫落，影響第2 年樹勢(shì)，進(jìn)而影響產(chǎn)量。目前，關(guān)于棗樹葉緣褐斑病的報(bào)道較少見，引發(fā)該病的致病菌種類也尚不明確，給其防治工作帶來一定的困難。基于此，筆者從南疆地區(qū)棗樹主要種植區(qū)采集典型的葉緣褐斑病的病葉，從病葉中分離獲得病原菌，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行分析，并結(jié)合rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 多基因聯(lián)合序列分析對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期明確南疆地區(qū)棗樹葉緣褐斑病的病原菌種類，進(jìn)而為防治此類病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從新疆阿克蘇、喀什、和田等主要棗樹種植區(qū)采集病葉，進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)采用常規(guī)組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離與純化[4]。將分離物置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行2～3 次純化[5]，最后以單孢純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定將在PDA 上培養(yǎng)10 d 的病原菌，用無菌水制成孢子懸浮液，置于10×40 倍顯微鏡下鏡檢，每個(gè)視野懸浮液中分生孢子量為20～40 個(gè)。選擇健康的棗葉，采用有傷方式接種病原菌孢子懸浮液，每個(gè)處理10 片，重復(fù)3 次。具體做法是用清水清洗棗葉，再用75%酒精表面消毒，最后用無菌水沖洗2～3 次，晾干，用滅過菌的接種針刺傷棗葉，將孢子懸浮液噴霧接種到有傷的棗葉上，以無菌水作為對(duì)照，然后放入事先鋪有濕潤濾紙的搪瓷盆中，在25℃培養(yǎng)箱中按12 h/12 h 光暗交替培養(yǎng)，接種后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率[6-7]。將接種后發(fā)病的棗葉進(jìn)行病原物的再次分離，通過培養(yǎng)外觀及顯微鏡等觀察病原物的特征，確定分離得到的病菌為同一病原菌。

1.2.3 病原菌的鑒定（1）形態(tài)學(xué)鑒定。將病原菌接種到PCA 培養(yǎng)基上置于25℃培養(yǎng)箱中，12 h/12 h 黑暗交替培養(yǎng)5 d 后，觀察分生孢子的形態(tài)特征，并在在徠卡熒光數(shù)碼顯微鏡下觀察病原菌的產(chǎn)孢表型[8-9]。根據(jù)分生孢子、分生孢子梗和產(chǎn)孢表型等特征，對(duì)照《中國真菌志 第十六卷 鏈格孢屬》[10]中的記錄初步確定病原菌的屬種。（2）分子生物學(xué)鑒定。參照劉振亞等[2]的研究方法獲取菌絲體，將菌絲體在40℃烘干后，放入滅菌EP 管中備用。采用CTAB 法提取菌絲基因組DNA[11-12]。病原菌rDNA-ITS 擴(kuò)增采用ITS1 和ITS4 引物，EF-1α基因擴(kuò)增采用EF1-728F和EF1-986R 引物；β-tubulin基因擴(kuò)增采用Beta-F 和Beta-R[12-13]引物，引物序列見表1，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參考唐淬[14]和臧睿[15]的方法。將擴(kuò)增產(chǎn)物送到華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得序列后，登陸NCBI 網(wǎng)站，下載鏈格孢屬不同種的序列和相似序列，使用MEGA6. 06 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，設(shè)置1 000 次重復(fù)。

表1 PCR 所需引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

用常規(guī)組織分離法，從病葉上分離純化出2 種真菌分離物，分別編號(hào)為HTYT-1 和HTYT-2。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

將HTYT-1和HTYT-2接種到棗葉上，如圖1所示，HTYT-2 菌種刺傷接種7 d 后，葉片上刺傷處可見褐斑，15 d 后刺傷接種的葉片發(fā)病率達(dá)到73%（圖1），其發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀一致，而HTYT-1 刺傷接種以及對(duì)照處理均未見發(fā)病癥狀。從發(fā)病的葉片病健交界處取葉片組織再次分離微生物[16]，獲得了與原分離菌株一致的病原菌。依據(jù)柯赫氏法則，可以確定HTYT-2 為棗樹葉緣褐斑病的致病菌。

圖1 棗樹葉緣褐斑病的發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將HTYT-2 接種在PCA 平板上，于25℃在近紫外燈和日光燈下12 h/12 h 光暗交替培養(yǎng)5 d，菌落初期為白色，后期逐漸變深為綠色與褐色相間，邊緣灰白色，圓形、邊緣整齊。在PCA+濾紙上培養(yǎng)5 d 后，觀察發(fā)現(xiàn)其分生孢子為棒狀（圖2），孢子基部鈍圓，具橫縱隔2～5 個(gè)，分隔處略縊縮；孢身大小為（15.49～45.73）×（7.48～17.36） μm，平均27.49×12.03 μm；喙呈短柱狀，大小為（0～14.68）×（0～6.02） μm，平均4.56×3.76 μm；分生孢子梗略彎曲、分枝，大小為（11.82～47.62）×（3.49～4.73） μm，平均4.25×26.31 μm。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，參照《中國真菌志 第十六卷 鏈格孢屬》中的記載，初步鑒定該病原菌為鏈格孢屬鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissler]。

圖2 病原菌HTYT-2 的形態(tài)特征

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 單基因的分子系統(tǒng)學(xué)分析獲得序列后，登陸NCBI 網(wǎng)站，下載鏈格孢屬不同種的序列和相似序列，用MEGA6. 06 軟件中的 Neighbour-joining 方法生成NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析?；贗TS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，HTYT-2 與A.solani、A.alternata、A.gaisen、A.tenuissima、A. brassicae聚在一個(gè)大的分枝下，其相似率為64%，因此僅通過ITS 序列不能將HTYT-2 鑒定到具體的種。基于EF-1α 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示，HTYT-2 與A.alternata（KJ008710、KF644357、KJ638247、KJ008705、KF644357、AY438647S1）聚為一組，其相似率為64%?；讦?tubulin 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）顯 示，HTYT-2 與A.alternata（KJ008681、KJ008682、KF680871）聚在一起，其相似率為90%。根據(jù)EF-1α序列和β-tubulin 序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，將HTYT-2 鑒定為鏈格孢屬鏈格孢A.alternata。

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于EF-1α 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于β-tubulin 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.2 多基因序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析使用Sequence Matrix 將ITS、EF-1α、β-tubulin 序列按前后順序串聯(lián)，利用PAUP4b10 軟件，采用uncorrected（"p"）核苷酸取代模型，以Plespora herbarum為外群，建立多基因的Neighbor-joining （NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)病原菌進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析。由圖6 可知，菌株HTYT-2 與不同登錄號(hào)的A.alternata（KU324782、KX783388、KX783397）聚在一個(gè)分支，說明菌株HTYT-2 與A.alternata的親緣關(guān)系最近，由此可以確定菌株HTYT-2 的種類為A.alternata。

圖6 基于ITS、EF-1α、β-tubulin 多序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

該研究從南疆棗樹主要種植區(qū)采集典型的葉緣褐斑病的病葉，從中分離純化獲得HTYT-1 和HTYT-2這2 種菌株，經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證，明確HTYT-2 菌株為棗樹葉緣褐斑病的致病菌。經(jīng)形態(tài)特征和多基因序列聯(lián)合分析，確定該菌株為鏈格孢菌[Alternaria alternata（Fr.）Keissler]。

在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的鏈格孢屬種級(jí)分生孢子形態(tài)特征有較大的變化，同屬不同種的分生孢子形態(tài)特征在一定培養(yǎng)條件下具有趨同現(xiàn)象[8]，給準(zhǔn)確鑒定到種以及小孢子種帶來了較大的困難[17]，而采用分子生物學(xué)方法結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定可以解決這一問題[18]。但單靠ITS 序列不能提供足夠的信息位點(diǎn)來分析屬以下某些種間的差異[19]，有時(shí)基于ITS 序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹并不準(zhǔn)確，甚至可能得出錯(cuò)誤的種類鑒定結(jié)果[20]，因此僅僅通過ITS 序列無法準(zhǔn)確鑒定菌株的種類。而多基因聯(lián)合序列分析具有選擇基因數(shù)量存在靈活性、結(jié)果準(zhǔn)確、適用物種范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[21]，被廣泛應(yīng)于鏈格孢屬的種別鑒定。羅歡等[22]使用rDNA-ITS、EF-1α、GAPDH 多基因序列分析將波斯菊葉枯病新病原菌確定為侵染向日葵鏈格孢A. helianthiinficiens；李番等[23]利用ITS 和β-tubulin 序列建立聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，將石竹葉斑病病原鑒定為石竹鏈格孢A.nobilis。因此，利用形態(tài)學(xué)鑒定，并結(jié)合多基因聯(lián)合序列[24-25]建立系統(tǒng)發(fā)育樹，可提高對(duì)鏈格孢屬種別鑒定的準(zhǔn)確性，并明確病原菌的分類地位，從而為防治棗樹葉緣褐斑病提供了理論依據(jù)。