劉定相 張 倩 張 田 余 霞

（1.安順市疾病預(yù)防控制中心，貴州 安順 561000）

（2.關(guān)嶺自治縣疾病預(yù)防控制中心，貴州 安順 561300）

前言

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜，共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂，分布于水生環(huán)境、魚蝦中，能夠?qū)е卖~類等水生動物的死亡，人可通過食用霍亂弧菌污染的魚蝦引起霍亂。氣單胞菌屬廣泛分布于自然界，可從水源、土壤以及人的糞便中分離，一定條件下能夠感染水產(chǎn)動物，導(dǎo)致出血病、潰瘍綜合征、赤皮、腸炎等疾病，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失，也可引起人類腹瀉等多種感染。近年來貴州省外仍有水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中存在霍亂弧菌、氣單胞菌污染的報道。貴州省內(nèi)有市售水產(chǎn)品中霍亂弧菌污染方面的報道，并無水產(chǎn)養(yǎng)殖霍亂弧菌、氣單胞菌污染的調(diào)查報道。

目前，關(guān)嶺自治縣正大力發(fā)展水產(chǎn)養(yǎng)殖，積極探索鄉(xiāng)村振興策略，為了解關(guān)嶺縣水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中霍亂弧菌、氣單胞菌污染狀況，為本地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)防治霍亂弧菌、氣單胞菌和降低因食用污染的水產(chǎn)動物引起食源性疾病風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

實驗樣本來自關(guān)嶺自治縣城區(qū)周邊水產(chǎn)動物養(yǎng)殖戶池塘或水庫的養(yǎng)殖水體、污泥及水產(chǎn)動物樣本共計62份。

1.2 方法

依據(jù)國家食品安全評估中心發(fā)布的《2020年國家食品污染物和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》中《霍亂弧菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作程序》和《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》（GB/T 18652-2002）對樣本進行霍亂弧菌、氣單胞菌的培養(yǎng)、分離，結(jié)合梅里埃公司VITEK 2 Compact30全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)對細(xì)菌進行鑒定；運用實時熒光PCR技術(shù)測定霍亂弧菌CTXAB毒力基因。

1.3 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、生物顯微鏡、VITEK 2 Compact30全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)、LightCycler 480實時熒光定量PCR儀。

1.4 主要試劑

3%氯化鈉堿性蛋白胨水、氧化酶試紙、嗜鹽性胰胨水（含氯化鈉0%、6%、8%、10%）、革蘭染液（由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)），科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（由上海欣中生物工程有限公司生產(chǎn)），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)），GN鑒定卡（梅里埃生物科技有限公司生產(chǎn)），霍亂弧菌診斷血清（由杭州天潤生物制品公司生產(chǎn)），霍亂弧菌CTXAB核酸檢測預(yù)分裝試劑盒（由深圳生科原生物有限公司生產(chǎn)），所使用試劑均在有效期內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計分析

將調(diào)查監(jiān)測結(jié)果錄入計算機建立數(shù)據(jù)庫，利用SPSS 24.0對水產(chǎn)養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物樣本中霍亂弧菌、氣單胞菌的檢出率進行統(tǒng)計分析。

2.結(jié)果

2.1 霍亂弧菌檢測情況

2020-2021年關(guān)嶺自治縣城區(qū)周邊水產(chǎn)動物養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物樣本進行霍亂弧菌檢測，不同水產(chǎn)養(yǎng)殖樣本霍亂弧菌檢出情況見表1。

表1 不同水產(chǎn)養(yǎng)殖樣本中霍亂弧菌檢測情況

數(shù)據(jù)顯示，養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物62份樣本中有2份檢出霍亂弧菌，總檢出率3.23%（2/62）。23份養(yǎng)殖水中1份檢出霍亂弧菌，檢出率4.35%（1/23）；23份污泥樣本中1份檢出霍亂弧菌，檢出率4.35%（1/23），水產(chǎn)動物樣本中未檢出霍亂弧菌。養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物三類樣本中霍亂弧菌的檢出率存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=6.000，P=0.05）。

2.2 氣單胞菌檢測情況

對2020-2021年關(guān)嶺自治縣城區(qū)周邊水產(chǎn)動物養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物樣本進行氣單胞菌檢測，不同水產(chǎn)養(yǎng)殖樣本氣單胞菌檢出情況見表2。

表2 不同水產(chǎn)養(yǎng)殖樣本中氣單胞菌檢測情況

監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物62份樣本中有2份檢出氣單胞菌，總檢出率3.23%（2/62）。23份養(yǎng)殖水中2份檢出氣單胞菌，檢出率8.70%（2/23）；污泥、水產(chǎn)動物樣本中均未檢出氣單胞菌。養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物樣本中氣單胞菌的檢出率存在統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=6.000，P=0.05）。

2.3 霍亂弧菌相關(guān)檢測情況

使用霍亂弧菌診斷血清對環(huán)境樣本分離的霍亂弧菌進行血清學(xué)分型，運用實時熒光定量PCR技術(shù)對霍亂弧菌是否攜帶CTXAB毒力基因進行定性測定。

2.3.1 霍亂弧菌血清學(xué)分型。對同一個養(yǎng)殖點環(huán)境樣本中分離的2份霍亂弧菌進行血清分型，霍亂弧菌血清學(xué)玻片凝集結(jié)果顯示，2份霍亂弧菌對多價O1群診斷血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稻葉型、小川型、彥島型及O139群診斷血清均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，菌株鑒定均為O1群非稻葉型、非小川型、非彥島型霍亂弧菌。無菌生理鹽水組無凝集現(xiàn)象。結(jié)果見表3。

2.3.2 霍亂弧菌毒力基因檢測。利用實時熒光定量PCR技術(shù)對分離出的2份霍亂弧菌進行CTXA毒力基因定性測定，結(jié)果均為陰性。無菌生理鹽水組為陰性。結(jié)果見表3、表4。

表3 2份霍亂弧菌血清學(xué)分型及毒力基因檢測情況

表4 2份霍亂弧菌CTXAB毒力基因?qū)崟r熒光PCR定性檢測曲線圖

結(jié)果顯示，環(huán)境樣本中分離的2份霍亂弧菌為01群霍亂弧菌，均未攜帶CTXAB毒力基因。

3.討論

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）是革蘭氏染色陰性，彎曲或呈逗點狀的需氧桿菌，廣泛分布在水生環(huán)境中，是水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中常見的致病菌，大量繁殖可導(dǎo)致養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物出現(xiàn)病變、死亡，人因食用被污染的水產(chǎn)動物易引起霍亂。本次監(jiān)測的62份樣本中，2份樣本檢出霍亂弧菌（檢出率3.23%），是關(guān)嶺縣首次在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中檢出嗜鹽性弧菌，可能與霍亂弧菌的生長特性有關(guān)，霍亂弧菌在無鹽或低鹽、PH8.8-9.0的水環(huán)境中生長良好，關(guān)嶺縣屬于淡水較豐富的地區(qū)，多數(shù)水環(huán)境pH酸堿度接近中性，養(yǎng)殖環(huán)境仍存在符合霍亂弧菌生長的條件，因此，相關(guān)部門應(yīng)加強對水產(chǎn)養(yǎng)殖的關(guān)注。

CTXAB基因是霍亂弧菌霍亂毒素的編碼基因，攜帶CTXAB毒力基因的霍亂弧菌容易導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病變、死亡，可引起人類腸道疾病霍亂的發(fā)生。本次污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，污染養(yǎng)殖環(huán)境中的O1群霍亂弧菌均未攜帶CTXAB毒力基因，說明養(yǎng)殖環(huán)境中霍亂弧菌這與李成偉、李濤、劉祥亮等調(diào)查一致。

氣單胞菌廣泛分布于自然界的土壤、水環(huán)境中，屬于條件致病菌，主要感染魚類、兩棲類、爬行類、哺乳類等多種動物，同時也是畜禽、水產(chǎn)等肉類食品重要的傳染源。水產(chǎn)動物因生活在水環(huán)境中，當(dāng)出現(xiàn)養(yǎng)殖水質(zhì)惡化、機體損傷等，較易遭受感染。本次調(diào)查結(jié)果顯示，62份樣本中2份樣本檢出氣單胞菌，檢出率3.23%，污泥、水產(chǎn)動物樣本未檢出氣單胞菌，提示水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)境已被氣單胞菌污染，因此，弄清污染來源對采取針對性防控措施具有重要意義。

如今，國內(nèi)交通、物流行業(yè)日益發(fā)達，內(nèi)陸與沿海地區(qū)物品流通頻率高，可能存在從沿海地區(qū)購入水產(chǎn)養(yǎng)殖魚、蝦苗情況，霍亂弧菌可能會從沿海地區(qū)向內(nèi)陸蔓延，會成為影響關(guān)嶺縣食品安全的風(fēng)險因素。本次對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中養(yǎng)殖水、污泥、水產(chǎn)動物三類樣本進行霍亂弧菌污染狀況的檢驗，2份樣本檢出霍亂弧菌，霍亂弧菌檢出樣本為同一魚類養(yǎng)殖點，為有流動水源少量流入的魚類養(yǎng)殖池塘，采樣前有外購魚苗入塘情況，后續(xù)出現(xiàn)魚類死亡現(xiàn)象。本次調(diào)查中，由于未采集到流入水源樣本和魚標(biāo)本，不能充分分析出霍亂弧菌污染唯一來源，但該養(yǎng)殖池塘的水體、污泥均有檢出霍亂弧菌，說明養(yǎng)殖環(huán)節(jié)存在霍亂弧菌污染的風(fēng)險。

綜上所述，關(guān)嶺縣水產(chǎn)養(yǎng)殖水、污泥等環(huán)境樣本中存在霍亂弧菌、氣單胞菌的污染，相關(guān)部門應(yīng)高度關(guān)注，持續(xù)加強對水產(chǎn)養(yǎng)殖各環(huán)節(jié)、水環(huán)境中氣單胞菌、霍亂弧菌污染及毒力狀況、藥物敏感性監(jiān)測，以及時采取措施，減少關(guān)嶺縣水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失，降低因食用霍亂弧菌、氣單胞菌污染的水產(chǎn)動物引起食源性疾病等的傳播風(fēng)險。