王俊麗，陳春喜，鄧展瑞

（1.甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，甘肅蘭州 730050；2.蘭州交通大學，甘肅蘭州 730070）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一類強致癌、致畸形的真菌毒素，它主要是黃曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）次級代謝產(chǎn)生的二氫呋喃氧雜萘鄰酮衍生物，其致癌特性的來源是香豆素結構，毒性來源是二氫呋喃環(huán)結構[1]。已分離鑒定的黃曲霉毒素有 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等18種，其中黃曲霉毒素B1（ Aflatoxin B1，AFB1）是已發(fā)現(xiàn)的AFT中毒性及致癌性最強的，1993年國際癌癥研究機構（IARC）將AFB1劃分為I類致癌物[2]。AFB1對肝臟及免疫系統(tǒng)有強抑制性，對人畜有很強的致癌、致突變、致畸性[3-4]。

目前，食品中常用的AFB1脫毒方法有物理法、化學法、生物法及基因干預4種方法。生物法去除AFB1效率最高、特異性最強、污染最小[5]。生物利用本身特異性結構或代謝產(chǎn)物吸附、修飾、破壞AFB1毒性分子結構，達到脫毒的效果[6-7]。本研究團隊從35份采集自甘肅省不同地域的西北酸菜樣品中篩選到一株AFB1吸附率高達66.4%的布氏乳桿菌L34-2，該菌株解吸后仍保留53.7%的吸附率。本研究通過正交試驗優(yōu)化菌株L34-2的脫毒條件，提高菌株吸附率、穩(wěn)定性，同時對脫毒機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

研究團隊從西北酸菜中分離篩選到一株布式乳桿菌（Lactobacillus buchneri）L34-2，菌株 L34-2優(yōu)化前AFB1脫毒率為66.4%。

1.1.2 試劑

（1）基礎培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基（CM188）、莫匹羅星鋰鹽（P-109）、半胱氨酸鹽酸鹽（P-03）、MC培養(yǎng)基（CM156）、磷酸鹽緩沖液（CM1022）、營養(yǎng)瓊脂（CM107）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（CM123）、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CM123A）、緩沖蛋白胨水（CM201），以上培養(yǎng)基均由北京陸橋提供。

（2）HPLC-MS/MS試劑。二氯甲烷（色譜純，sigma）；甲醇（色譜純，sigma）；乙腈（色譜純，sigma）；苯（色譜純，sigma）。

（3）酶類。雞卵白自溶酶（Sigma，USA）；蛋白酶（Sigma，USA）。

1.2 儀器設備

1300 SERLES A2-1379型生物安全柜，賽默白世爾（蘇州）儀器有限公司；QTRAP 4500超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，SCIEX；16-09405恒溫鼓風干燥箱，BINDER。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理方法

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r·min-1離心15 min分離，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后過免疫親和柱，用超純水洗濾2遍，然后用甲醇（色譜純）洗脫，收集洗脫液。

1.3.2 超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

液相色譜：色譜柱（C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱箱溫度：40 ℃；流動相（乙酸銨/甲醇）；質(zhì)譜條件：電離方式：電噴霧電離（ESI+）；檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；氣簾氣（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：medium；離子化電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣（GSI）：55 psi；輔助加熱器（GS2）：60 psi[8]。

1.4 單因素對菌株脫毒效率的影響

1.4.1 發(fā)酵溫度對AFB1脫毒率的影響

參考WANG等[9]研究溫度對AFB1生物脫毒率的影響，制備109CFU·mL-1菌懸液，氧氣供應量100%，以30 mL/300 mL比例接種于AFB1濃度為10 ng·mL-1的發(fā)酵液中，發(fā)酵溫度分別為25 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃和 40 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，研究發(fā)酵溫度對菌株AFB1脫毒率的影響，得到適宜菌株脫毒的溫度范圍。

1.4.2 相同濃度菌懸液不同比例接種對AFB1脫毒率的影響

制備109CFU·mL-1菌懸液，氧氣供應量100%，發(fā)酵溫度為36 ℃，不同比例接種，分別為0 mL/300 mL、40 mL/300 mL、50 mL/300 mL、60 mL/300 mL 和75 mL/300 mL，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，研究接種比例對AFB1脫毒率的影響，得到菌株最適宜的接種比例范圍。

1.4.3 氧氣濃度對AFB1脫毒率的影響

制備109CFU·mL-1菌懸液，發(fā)酵溫度為36℃，接種比例為30 mL/300 mL，在培養(yǎng)過程中控制氧氣的濃度為0%、20%、50%、75%和100%，測定氧氣濃度對菌株AFB1脫毒率的影響，得到菌株發(fā)酵最佳氧氣供應量范圍。

1.4.4 發(fā)酵液pH值對AFB1脫毒率的影響。

結合SHU等[10]的研究發(fā)現(xiàn)pH值對AFB1生物脫毒率有影響，制備109CFU·mL-1菌懸液，發(fā)酵溫度為36 ℃，接種比例為30 mL/300 mL，氧氣供應量為100%，控制發(fā)酵液pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，研究發(fā)酵液pH值對菌株AFB1脫毒率的影響，優(yōu)化菌株發(fā)酵液pH值。

1.5 菌株脫毒發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結果篩選影響菌株脫毒率的因素范圍，利用minitab軟件設計L9(34)正交實驗，從發(fā)酵溫度、接種量比例、氧氣濃度和發(fā)酵液pH值4個因素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，以菌株脫毒率為統(tǒng)計量，對結果進行統(tǒng)計學極差分析，得到菌株小規(guī)模發(fā)酵脫毒最優(yōu)條件，提高菌株脫毒能力。各因素正交實驗設計見表1。

表1 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗設計表

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復3次，結果采用Excel及Minitab軟件中數(shù)據(jù)分析進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)間的顯著性差異分析采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素發(fā)酵條件對L34-2菌株AFB1脫毒率的影響

2.1.1 發(fā)酵溫度對L34-2菌株AFB1脫毒率的影響

發(fā)酵溫度影響菌體的生長，單因素發(fā)酵條件選擇培養(yǎng)溫度在25～40 ℃，篩選菌株適宜的生長溫度范圍，提高菌株AFB1脫毒能力，菌株在30 ℃培養(yǎng)時，菌體生長量最高，AFB1脫毒能力較未優(yōu)化活菌有較高增加，脫毒率為76.1%，如圖1，將發(fā)酵溫度列為正交實驗影響因素。

圖1 發(fā)酵溫度對菌株AFB1吸附率的影響

2.1.2 接種比例對AFB1脫毒率的影響

單因素發(fā)酵條件選擇接種比例在30 mL/300 mL～75 mL/300 mL，如圖2，接種量為50 mL/300 mL，菌株接種發(fā)酵48 h，AFB1脫毒效率提高為77.6%，75 mL/300 mL接種量過于密集，菌株對AFB1的脫毒率不是隨著接種量增加而增強。通過接種量的比較，選擇能提高菌株脫毒率的接種比例為正交實驗考慮的因素水平。

圖2 接種比例對菌株L34-2 AFB1吸附率的影響

2.1.3 不同氧氣濃度對菌株AFB1脫毒率的影響

根據(jù)研究布氏乳桿菌為兼性厭氧菌，如圖3，單因素發(fā)酵條件選擇氧氣濃度0%～100%，篩選L34-2菌株發(fā)酵脫毒時最適宜氧氣供應量。氧氣供應量在50%時，菌株L34-2 AFB1脫毒率提高為78.4%。將氧氣供應量作為正交試驗的參考因素。

圖3 氧氣供應量對菌株L34-2 AFB1吸附率的影響

2.1.4 發(fā)酵液pH對菌株L34-2 AFB1脫毒率的影響

單因素發(fā)酵條件選擇發(fā)酵液pH值4.5～8.5，如圖4，篩選L34-2菌株脫毒率大幅提高的發(fā)酵液pH值范圍。發(fā)酵液pH值在4.5時，菌株L34-2 AFB1脫毒率最高為80.5%，菌株L34-2生長及AFB1脫毒適宜pH值低的環(huán)境，將發(fā)酵液pH值作為正交試驗考慮因素。

圖4 發(fā)酵液pH值對菌株L34-2 AFB1吸附率的影響

2.2 正交試驗菌株脫毒發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗選擇對菌株脫毒率有較大提高的發(fā)酵溫度、接種比例、氧氣供應量和發(fā)酵pH值，設計4因素3水平的正交試驗，選擇菌株脫毒最適宜的條件。由表2知，菌株L34-2脫毒過程中影響AFB1脫毒率的單因素順序為發(fā)酵溫度（4.03）＞發(fā)酵液pH值（3.83）＞接種比例（3.57）＞氧氣供應量（2.23）。結合各因素水平作用效果分析，選擇優(yōu)化后的菌株L34-2發(fā)酵脫毒條件為發(fā)酵溫度30 ℃，控制發(fā)酵液pH值4.0，接種比例為50 mL/300 mL，氧氣供應量60%，優(yōu)化條件后，菌株L34-2脫毒率為87.5%，比優(yōu)化前提高21.1%脫毒率。

表2 正交實驗優(yōu)化菌株脫毒條件極差分析表

3 結論與討論

布氏乳桿菌L34-2脫毒的最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵液pH值4.0，接種比例為50 mL/300 mL，氧氣供應量60%，優(yōu)化后菌株脫毒率提高到87.5%，比優(yōu)化前提高21.1%。依據(jù)正交實驗極差統(tǒng)計分析結果，發(fā)酵溫度對菌株L34-2脫毒率影響最大。菌株L34-2對AFB1的脫毒主要是菌體對AFB1的吸附，吸附主要在細胞壁上進行，其中肽聚糖為主要吸附結構，胞外多糖為輔助吸附結構。關于吸附條件的優(yōu)化，不同菌種有不同的要求，與邵帥等[11]研究優(yōu)化降解黃曲霉素B1菌株發(fā)酵條件同樣都優(yōu)化發(fā)酵溫度和接種比例，但增加發(fā)酵液pH值及供氧量，結果表明發(fā)酵液pH值及供氧量可顯著提升菌株脫毒率。黃麗等[12]從中國傳統(tǒng)乳制品中分離的C88植物乳桿菌胞外多糖對AFB1沒有吸附作用，由于本研究菌種來源于西北特色酸菜中，篩選的功能菌的胞外多糖具有一定的吸附功能，這一點國內(nèi)研究報道相對較少。以上所有關于專用菌種脫毒AFB1的研究，多處于實驗室階段，真正能用在國家大規(guī)模商品糧生物脫毒工藝的菌種以及脫毒條件，尚處空白。因此，工業(yè)化脫毒生物菌種以及脫毒條件未來應成為研究的重點方向。