劉 葉，孫愛(ài)玲

（壹諾（天津）檢測(cè)服務(wù)有限公司，天津 300383）

氯霉素[1-2]作為一種典型的抗生素，在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、家禽飼養(yǎng)等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。但氯霉素具有一定的毒性，會(huì)對(duì)人們的血液系統(tǒng)造成損害，甚至有可能引起再生障礙性貧血，且該癥狀是不可逆的。因此，氯霉素的毒副作用引起了人們的重視，如何減少氯霉素的使用頻率也成為了熱點(diǎn)話題。為了減少該藥品的濫用對(duì)于人們?cè)斐傻膫?，?guó)家相關(guān)部門于2002年發(fā)布農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》，對(duì)該藥品的使用進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，氯霉素及其相關(guān)化學(xué)品被禁止在食用動(dòng)物上使用。隨后，發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第五批）》（整頓辦函〔2011〕1號(hào)）明確規(guī)定肉制品中不得檢出氯霉素。

測(cè)量不確定度是一個(gè)非負(fù)參數(shù)[3-10]，用來(lái)表明實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的結(jié)果之間所存在的分散性。此外，由于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)一定的測(cè)量誤差，不確定度的測(cè)定有助于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。本文結(jié)合相關(guān)資料[11-15]，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）、《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)定指南》（CNAS—GL006：2019）等相關(guān)文件對(duì)液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定香腸中氯霉素的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher TSQ Quantis 液相色譜-質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源；ME 204分析天平；JW-2022HR冷凍離心機(jī)；XW-80A混合儀、HSC 24 B氮吹儀。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.24%；氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)；乙腈，HPLC級(jí)；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水氯化鈉，分析純；HyperSep Retain-PEP SPE 柱；0.45 μm有機(jī)相濾膜；實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取50 mg氯霉素于100 mL容量瓶中，緩慢加入乙腈溶液并定容，得到氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500 μg·mL-1）。然后于 10 mL 容量瓶中加入 20 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液并使用乙腈定容，得到標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg·mL-1）。使用移液槍抽取 5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和500 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液于提前準(zhǔn)備好的5支不同容量瓶（10 mL）中，并在其中均加入1 mL氘代氯霉素作為內(nèi)標(biāo)工作液，定容，得到一系列氯霉素濃度為 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中氘代氯霉素的濃度為 10 ng·mL-1。

1.2.2 測(cè)定方法

稱5 g絞碎均質(zhì)的香腸樣品于50 mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)液100 μL，加入3 mL水和一粒陶瓷均質(zhì)子，混勻，加入乙腈 5 mL，渦旋并置于冷凍離心機(jī)中10 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入另一50 mL離心管，在殘?jiān)性偌尤階CN 5 mL，重復(fù)提取一次，兩次上清液倒入同一離心管，隨后加入4 g Na2SO4和 1 g NaCl，渦旋，8 000 r·min-1離心 5 min?；罨腿≈?，將離心后的溶液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，收集流出液。40 ℃的條件下，氮?dú)獯蹈桑? mL水定容，過(guò)0.45 μm膜測(cè)定。

1.3 不確定度模型

不確定度數(shù)學(xué)模型為

式中：X為試樣中待測(cè)組分殘留量，μg·kg-1；C為樣液中待測(cè)物的濃度，ng·mL-1；V為試樣定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

從測(cè)定過(guò)程和確定的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，氯霉素測(cè)定不確定度的來(lái)源有以下8方面：①氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和中間液配制產(chǎn)生的不確定度；②容量瓶引入的不確定度；③移液槍引入的不確定度；④標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度；⑤樣品稱量產(chǎn)生的不確定度；⑥樣品定容體積產(chǎn)生的不確定度；⑦樣品重復(fù)測(cè)定引起的不確定度；⑧液質(zhì)聯(lián)用儀引起的不確定度。

2.2 濃度C引入的不確定度urel(C)

2.2.1 重復(fù)性引起的不確定度urel(C1)

對(duì)樣品中的氯霉素含量進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。其標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=重 復(fù) 測(cè)定產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(C1)=0.026 4 ng·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 重復(fù)測(cè)量濃度C的數(shù)據(jù)結(jié)果表

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度urel(C2)（1）氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和中間液配制產(chǎn)生的不確定度urel(C2標(biāo))。將50 mg標(biāo)準(zhǔn)品用色譜純乙腈溶于100 mL容量瓶中，隨后定容。氯霉 素 的 純 度 為（99.23±0.77）%， 其 中k=2。 因此，由純度的微小變化所引入的相對(duì)不確定度為

根據(jù)檢定證書(shū)的內(nèi)容可知，實(shí)驗(yàn)所用型號(hào)的天平允許誤差通常是±0.5 mg，按均勻分布，則由稱量準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)不確定度分別為

100 mL容量瓶定容引入的不確定度：100 mL容量瓶的誤差范圍是0.1 mL，按矩形分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V100)=0.057 7 mL。室內(nèi)溫度為（20±5）℃，而由溫度波動(dòng)引起的體積變化通常是呈均勻分布的，k=乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3，由此可得到溫度波動(dòng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V100t)=0.395 mL。則100 mL容量瓶定容引入的相對(duì)不確定度為

10 mL容量瓶定容體積引入的不確定度：根據(jù)計(jì)量書(shū)所提供的數(shù)據(jù)，10 mL容量瓶體積變化的允許誤差為±0.020 mL。按照矩形分布來(lái)計(jì)算相對(duì)不確定度，則為urel(V10)=0.001 2。由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度變化所導(dǎo)致容量瓶體積變化如上文所述，同理可得出溫度引起的相對(duì)不確定度為urel(V10t)=0.003 95。則10 mL容量瓶定容體積引入的相對(duì)不確定度為

1 000 μL 移 液 槍 移 取 1 000 μL 溶 液 時(shí) 產(chǎn) 生的容量允許誤差為±1%，按矩形分布，則移液槍移取體積所引入的相對(duì)不確定度為

因此，合成氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和中間液配制產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程產(chǎn)生的不確定度。①容量瓶引入的不確定度urel(V容)：容量瓶允許誤差是±0.020 mL，按矩形分布，相對(duì)不確定度為

溫度波動(dòng)通常也會(huì)導(dǎo)致物體的體積產(chǎn)生一些細(xì)微的變化，進(jìn)而影響測(cè)試的最終結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度是（20±5）℃，體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，因此溫度波動(dòng)引入的相對(duì)不確定度為

②移液槍引入的不確定度urel(V器)：不同移液槍的不同量程，其允許的最大誤差不同。即便是同樣容量的移液槍，在量取不同體積溶液時(shí)也往往會(huì)出現(xiàn)不同的允許誤差。例如，10 μL移液槍的允許誤差為±8%；50 μL移液槍移取5 μL溶液時(shí)產(chǎn)生的誤差為 ±8%、取50 μL 時(shí)為±3%；1 000 μL移液槍取100 μL溶液時(shí)產(chǎn)生的誤差為±2%、取500 μL時(shí)為±l%。按矩形分布，可得到不同移液槍引入的相對(duì)不確定度為

式中：Vi為不同移液體積，μL；ti為容量允差誤差；V器為移液槍規(guī)格，μL。

各相應(yīng)移液體積的容量允許誤差及相對(duì)不確定度見(jiàn)表2。

表2 移液槍移取不同體積溶液的相對(duì)不確定度表

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度urel(CX)

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定結(jié)果如表3所示，擬合可得Y=0.103 4X-0.008 157。

表3 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定結(jié)果

則移液槍引入的相對(duì)不確定度為

故合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

式中：S(Y)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；P為樣品溶液的測(cè)定次數(shù)，P=10；N為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，N=5；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；Cx為樣品溶液中待測(cè)物的濃度，ng·mL-1；c為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，ng·mL-1；ci為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；Yi為單次標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。

合成校準(zhǔn)過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

2.3 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度urel(m)

對(duì)于5 g樣品來(lái)說(shuō)，天平稱量時(shí)的最大誤差范圍是±0.000 5 g，按矩形分布，則樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為urel(m)=0.000 058。

2.4 樣品定容體積產(chǎn)生的不確定度urel(V樣)

移 液 槍 導(dǎo) 致 的 不 確 定 度：1 000 μL移液槍容量允差是±1.0%，按矩形分布，則

溫度波動(dòng)引起的體積不確定度：溫度波動(dòng)（20±5）℃，所引起的體積變化呈均勻分布，溶 液 體 積 膨 脹 系 數(shù) 為 2.1×10-4℃-1， 故溫度波動(dòng)引起的體積相對(duì)不確定度為urel(V樣t)=

2.5 液質(zhì)聯(lián)用儀引起的不確定度urel(Q)

根據(jù)儀器校準(zhǔn)證書(shū)可知，u=6%，k=2，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

將上述各分量合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

經(jīng)過(guò)10次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值可以得出所測(cè)試樣品中的氯霉素含量是0.98 μg·kg-1，由此可得

2.7 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果報(bào)告

95%置信概率下取包含因子k=2，將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子計(jì)算得到氯霉素測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為

U=u(X)×k=0.085×2=0.17 μg·kg-1

因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可報(bào)告表示為（0.98±0.17）μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本文使用液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)香腸中殘留的氯霉素含量進(jìn)行了檢測(cè)，建立了合適的數(shù)學(xué)模型對(duì)不確定度進(jìn)行計(jì)算模擬評(píng)估。結(jié)果表明，在香腸中氯霉素含量為0.98 μg·kg-1時(shí)，擴(kuò)展不確定度是0.17 μg·kg-1，k=2。進(jìn)一步分析可知，檢測(cè)過(guò)程中引入不確定來(lái)源對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，主要影響因素包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合與儀器校準(zhǔn)。與此相比，樣品質(zhì)量的準(zhǔn)確稱量、樣品的多次重復(fù)測(cè)試等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小。因此，在實(shí)驗(yàn)中要保證儀器性能穩(wěn)定，按時(shí)做好儀器日常維護(hù)保養(yǎng)，對(duì)移液器和容量瓶進(jìn)行定期計(jì)量，選擇精度高、靈敏度高的器械進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制，以期降低不確定度，提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度，從而為科研和檢測(cè)提供可靠的依據(jù)。