胡奕勤

（江西省撫州市檢驗檢測認(rèn)證中心，江西 撫州 344000）

獨活是一種傳統(tǒng)的中藥，是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸A.pubescentis Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根[1]，在我國四川、湖北、甘肅、重慶、貴州和山西省等地有廣泛分布[2]。香豆素又稱雙二乙烯基氧化物或1,2-苯并吡喃酮，已被證明是獨活中含量最豐富的生物活性物質(zhì)，目前已從獨活中分離和鑒定出60余種香豆素類成分[3]。香豆素最初用作香料，后發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗人體免疫缺陷病毒、抗高血壓、抗心律失常、抗骨髓骨質(zhì)疏松、鎮(zhèn)痛和光敏作用[4-6]。根據(jù)已發(fā)表的文獻，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素是主要的香豆素類藥用生物活性成分，并已被用作獨活的質(zhì)量控制指標(biāo)。

高效液相色譜法（HPLC）廣泛用于中藥定量分析，通常包括外標(biāo)法（ESM）和一測多評法（QAMS）。一測多評法用于表征中藥活性成分的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過僅測量一種成分（內(nèi)標(biāo)物）實現(xiàn)多組分的同步測定，并引入相對校正因子進行定量。外標(biāo)法需要使用所有待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品且測定對應(yīng)的含量，而一測多評法只需使用和測定內(nèi)標(biāo)物一種成分的含量[7]。在某種程度上，一測多評法不僅大大減少傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制的檢測時間和分析成本，且提高傳統(tǒng)中藥或植物產(chǎn)品質(zhì)量控制方法的實用性和可行性，被認(rèn)為是中藥及其制劑質(zhì)量控制的良好替代方法[8-9]。目前，2020年版《中國藥典》中采用HPLC分別測定蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量以控制獨活的質(zhì)量，其他文獻資料雖然也有一些采用HPLC同時測定獨活藥材中多成分含量控制其質(zhì)量的方法，但還沒有結(jié)合QAMS來控制獨活藥材質(zhì)量的相關(guān)報道[10-12]。本文建立了基于QAMS同時測定獨活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素3種活性成分含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（配2996型二極管陣列檢測器）；LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；ME104E型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 藥材與試劑

蛇床子素對照品（批號：110822-201911，≥98 %）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號111587-202009，≥98 %）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；異歐前胡素（批號：110827-200407，含量≥98 %，上海恒遠(yuǎn)）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。獨活藥材分別來自四川、湖北、甘肅、江西和山西省，按照藥典方法處理、干燥，粉碎，過40目篩，密封袋保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相為甲醇（A）-水（B），比例為65:35；流速1.0 ml/min；檢測波長325 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μl；樣品分析時間為25 min。在此色譜條件下，3種香豆素類成分及在獨活樣品中的色譜表征見圖1，各色譜峰分離效果較好，分離度＞1.5。

圖1 混合對照品（A）和獨活樣品（B）HPLC色譜圖

2.2 混合對照品溶液的制備

分別稱取蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素對照品各2.5 mg，用甲醇溶解于25 ml量瓶中定容，混勻。取1 ml該溶液置入10 ml量瓶，稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取獨活藥材粉末約25 mg，用100 ml甲醇超聲（40 min，40 ℃）提取2次，合并提取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓（60 ℃，80 r/min，0.07 MPa）濃縮，精密稱取30 mg濃縮提取物用2 ml甲醇超聲使溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 將混合對照品溶液用甲醇分別稀釋至濃度為80，40，20，10和5 μg/ml后注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果以峰面積y為縱坐標(biāo)，以各組分的濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性回歸

2.4.2 檢測限和定量限 取5 μg/ml的混合對照品溶液，用甲醇將其稀釋至各成分信噪比約為10:1，此時的相應(yīng)濃度即為各成分的定量限，繼續(xù)稀釋至信噪比為3:1，此時的相應(yīng)濃度即為各成分的檢測限。結(jié)果，獨活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的檢測限分別為2.2，2.7和1.7 μg/ml，定量限分別為7.3，9.1和5.7 μg/ml。

2.4.3 耐用性實驗 分別考察不同柱溫（25，30，35 ℃）、不同流速（0.8，1，1.2 ml/min）、不同流動相比率（60 %，65 %，70 %甲醇）等因素對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果，獨活中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素在25～35 ℃柱溫范圍內(nèi)，3種組分含量測定結(jié)果的RSD值分別為1.12 %，0.97 %和0.86 %，其中30 ℃分離效果最佳；在0.8～1.2 ml/min流速范圍內(nèi)3種組分含量測定結(jié)果的RSD值分別為1.35 %，1.46 %和1.52 %，分離效果均良好；在流動相甲醇含量為60 %～70 %范圍內(nèi)3種組分含量測定結(jié)果的RSD值分別為0.94 %，1.12 %和1.47 %，分離效果均良好。在考察范圍內(nèi)，柱溫、流速和流動相比率對測定結(jié)果無顯著影響，可用于獨活中3組分含量的測定。

2.4.4 精密度實驗 系統(tǒng)精密度試驗：精密吸取40 μg/ml濃度梯度混合對照品溶液20 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)6次進樣測定峰面積，分別計算RSD。結(jié)果，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的RSD值分別為0.38 %，0.40 %和0.52 %，表明方法的精密度良好。

中間精密度試驗：由不同人員（甲、乙、丙3個實驗者）使用不同的儀器，按照上述含量測定方法分別測定6份獨活藥材樣品中各組分的含量，并計算測定結(jié)果的RSD值。結(jié)果表明，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的RSD值分別為0.98 %，1.02 %和1.34 %，表明該分析方法中間精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性實驗 取同一批次獨活藥材6份，按照上述樣品制備方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下測定3種成分的含量和RSD值。結(jié)果表明，蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的含量分別為5.62，0.82和0.32 mg/g，RSD值分別為0.98 %，1.02 %和1.23 %，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實驗 取混合對照品溶液和獨活供試品溶液，分別在制備后的第0，2，4，8，12，16，24 h分別進樣20 μl，測定蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素的峰面積，計算對照品溶液3種組分的RSD值分別是0.87 %，1.04 %和0.97 %，供試品溶液3種組分的RSD值分別是1.12 %，1.38 %和1.24 %，表明在該檢測條件下對照品和供試品均是穩(wěn)定的。

2.4.7 加樣回收試驗 精密稱取已知各組分含量的獨活藥材粉末6份，分別加入與獨活樣品中各組分含量等量的3種對照品溶液，按照上述樣品制備方法制備供試品溶液并進行測定。每個樣品平行6次。加樣回收率結(jié)果見表2，結(jié)果表明，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的平均加樣回收率分別為100.58 %，100.01 %和102.30 %，RSD分別為1.06 %，1.27 %和2.39 %，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 獨活中3種成分的加樣回收率

2.5 相對校正因子的確定

2.5.1 相對校正因子的計算 精密吸取40 μg/ml的混合對照品溶液4，8，10，16，20 μl，按照優(yōu)化后的色譜條件進樣，記錄各組分的色譜峰面積。以蛇床子素（s）為內(nèi)標(biāo)物，采用多點法計算異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子（fk/s）分別為0.60±0.00800和0.58±0.00800，RSD值分別為1.30 %和1.04 %。

2.5.2 相對校正因子的耐用性 分別采用島津LC-2030和Waters 2695高效液相色譜儀，考察不同廠家的高效液相色譜儀器對相對校正因子的影響。結(jié)果使用島津LC-2030高效液相色譜儀得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子分別為0.59±0.00775和0.56±0.02350，RSD值分別為1.14 %和1.29 %；使用Waters 2695高效液相色譜儀得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子分別為0.60±0.00786和0.56±0.01272，RSD值分別為1.40 %和1.18 %。

分別采用安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱和漢邦 KU60826 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，考察不同色譜柱對相對校正因子的影響。結(jié)果，使用安捷倫Zorbax SB-C18色譜柱得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子分別為0.60±0.00820和0.56±0.01052，RSD值分別為1.36 %和1.24 %。使用漢邦 KU60826 C18色譜柱得到的異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子分別為0.59±0.01103和0.57±0.00935，RSD值分別為1.30 %和1.65 %。

此外，在其他色譜條件不變的情況下，考察了不同柱溫（20，25，30，35，40 ℃）和不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 ml/min）對相對校正因子的影響。結(jié)果，異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在不同流速下的相對校正因子分別為0.60±0.00801和0.57±0.00894，RSD值分別為1.37 %和1.31 %；在不同柱溫下的相對校正因子分別為0.60±0.00400和0.56±0.01010，RSD值分別為0.78 %和1.61 %。

結(jié)果表明，使用不同的儀器、色譜柱、流速和柱溫對相對校正因子影響較小。RSD值均小于2 %，所建立的獨活中3種香豆素類成分的測定方法適用于實際分析。

2.6 樣品含量測定

采用建立的QAMS法和ESM法同時測定了不同產(chǎn)地獨活藥材中3種香豆素類成分的含量，并比較兩種方法所得結(jié)果的差異，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當(dāng)蛇床子素用作內(nèi)標(biāo)物時，QAMS和ESM方法的結(jié)果無顯著性差異，表明QAMS法用于獨活藥材中3種香豆素類活性成分的含量測定可行性較高。

表3 不同方法測定獨活中香豆素類成分含量的結(jié)果比較

3 討論

3.1 樣本制備方法的選擇

在實驗前期選擇了不同的提取方法和提取溶劑對藥材的提取方案進行優(yōu)化。結(jié)果表明，相對超聲提取法，水蒸汽回流法和恒溫水浴加熱法提取時間較長（約3～5 h）且提取率較低；乙醇作為提取溶劑時3種香豆素類化合物的提取回收率均低于甲醇，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑進行超聲提取。

此外，對獨活提取液進行濃縮時比較了減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法和水浴干燥法。兩種方法所需的時間大致相同。然而，當(dāng)在水浴上干燥時，提取液與空氣直接接觸，易導(dǎo)致雜質(zhì)污染提取物。因此，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法來干燥獨活提取物。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

獨活藥材中含有多種香豆素類成分，但考慮對照品的價格和可用性，本實驗選定蛇床子素作為內(nèi)標(biāo)物計算異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的相對校正因子，能有效解決其余兩種中藥對照品稀缺、性質(zhì)不穩(wěn)定和價格昂貴等問題。

4 結(jié)論

本研究報告的QAMS方法可用于獨活中3種香豆素類活性成分的測定，并經(jīng)過方法學(xué)驗證是準(zhǔn)確、科學(xué)和可行的，適用于獨活藥材多指標(biāo)的質(zhì)量控制。此外，本研究首次報道的使用QAMS方法測定獨活藥材中3種香豆素類成分含量的新方法可為獨活及其制劑的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供指導(dǎo)。