黃琰鈺，林雪娟，陳杭，蘭萌，吳冬梅，劉文杰，劉艷紅

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122； 2.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建省2011中醫(yī)健康管理協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122； 4.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350122； 5.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院，福建 晉江 362200

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年7月至2020年12月就診于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院門診及住院的胚胎停育患者45例，年齡(30.82±5.05)歲。另選擇同期自愿要求終止妊娠的正常早孕女性15例為對(duì)照組，年齡(27.86±4.21)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》[4]胚胎停育的診斷標(biāo)準(zhǔn)及《早期妊娠稽留流產(chǎn)專家共識(shí)》[5]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 中醫(yī)證素診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《證素辨證學(xué)》[6]，根據(jù)采集的四診信息在診斷中的權(quán)重，以加權(quán)閾值法確定證素。將各項(xiàng)四診信息對(duì)某證素的貢獻(xiàn)度進(jìn)行累積相加，所得的貢獻(xiàn)度之和，作為該證素的積分。積分<70分為0級(jí)，說明基本無病理變化；積分 70～100分為1級(jí)，說明存在輕度病理變化；積分101～150分為2級(jí)，說明存在中度病理變化；積分≥150分為3級(jí)，說明存在嚴(yán)重病理變化。

1.3 病例納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 胚胎停育組納入標(biāo)準(zhǔn)妊娠7～12周內(nèi)并符合胚胎停育西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；自愿加入并簽署知情同意書后可配合完成四診問卷者。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCI-N87細(xì)胞株常規(guī)在含10%胎牛血清的0.1%DMSO培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%融合度時(shí)，以1：3比例進(jìn)行傳代。使活細(xì)胞數(shù)＞95%，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)妊娠7～12周內(nèi)早期妊娠超聲診斷有胎心者；自愿加入并簽署知情同意書，可配合完成調(diào)查問卷者。

1.4 病例排除標(biāo)準(zhǔn)①因跌撲損傷、染色體異常致胚胎停育者；②生化妊娠、試管嬰兒失敗后流產(chǎn)患者；③患有陰道炎、生殖道感染者；④合并高血壓、免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管病、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤等重大器質(zhì)性疾病或嚴(yán)重精神疾病者。

1.5 四診信息采集及證素提取

1.5.1 四診信息由2名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)且考核合格的中醫(yī)科研人員按照標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范地采集研究對(duì)象的四診信息。

1.5.2 證素?cái)?shù)據(jù)提取使用“中醫(yī)健康狀態(tài)辨識(shí)系統(tǒng)”[7]將采集到的四診信息錄入系統(tǒng)，后臺(tái)對(duì)四診信息進(jìn)行處理并輸出相關(guān)證素及其積分。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 辨證分型將證素、氣滯積分≥100分的組納入肝郁證，證素、氣滯積分<100分納入非肝郁證。

1.6.2 組織取材所有研究對(duì)象行清宮術(shù)后，立即在無菌狀態(tài)下取子宮蛻膜組織，用無菌生理鹽水清洗，直到組織表面無明顯血跡，用無菌剪刀將子宮蛻膜組織分別剪成兩部分，迅速放入無RNA酶的EP管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.6.3 儀器和設(shè)備電子天平(上海梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；微型漩渦混合儀XW-80A(上海滬西分析儀器廠有限公司)；迷你離心機(jī)LX-200(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；微型冷凍離心機(jī)5424R(德國(guó)Eppendorf公司)；超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scinetific公司)；移液器(德國(guó)EPPENDORF)；高通量自動(dòng)研磨儀Tissuelyser II(德國(guó)Qiagen公司)；超微量紫外分光光度計(jì)Nandrop2000(美國(guó)Thermo Scientific公司)；基因擴(kuò)增儀Veriti、熒光定量PCR儀 Quant Studio6 Flex(美國(guó)Applied Biosystems 公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀 ChemiDox TM XRS+(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.6.4 試劑及耗材體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無水乙醇(西隴化工股份有限公司)；氯化鈉(上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司)；Gapdh一抗、兔抗、Anti-pan-VEGF 一抗(北京Proteintech公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(萬類生物科技)；半干轉(zhuǎn)膜液、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜液、電泳液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑、SYBR Green RT-PCR 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)。

1.6.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

1.6.5.1 RNA逆轉(zhuǎn)錄使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，并根據(jù)RNA的濃度計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄時(shí)所需的RNA量。在1.0 %非變性瓊脂糖凝膠電泳上分析RNA完整性，其純度完整性達(dá)到要求后，進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。在冰上配制RT反應(yīng)液分別裝于反應(yīng)管中，再加入滅菌蒸餾水，使得總體積為18 μL，42 ℃，2 min后放置冰上。反應(yīng)管中直接添加入5×qRT SuperMixⅡ 6 μL，50 ℃，15 min；85 ℃，5 s，得到的cDNA放置-20 ℃冰箱中備用。

1.6.5.2 引物設(shè)計(jì)選用人的GAPDH為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的特異性引物，用Oligo 6.0檢驗(yàn)其特異性。引物由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.6.5.3 qPCR反應(yīng)在冰上配制反應(yīng)液，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL。吸取11 μL到每個(gè)反應(yīng)管中，再添加cDNA溶液1 μL。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照，配制反應(yīng)液時(shí)先配制總的反應(yīng)液，再各個(gè)分裝。反應(yīng)步驟為95 ℃×30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃×5 s，60 ℃×30 s，40個(gè)循環(huán)；Melt Curve：95 ℃×15 s，60 ℃×60 s。最后得到樣本擴(kuò)增曲線、溶解曲線和ct值，計(jì)算基因表達(dá)。

1.6.6 蛋白表達(dá)量檢測(cè)

1.6.6.1 BCA法檢測(cè)蛋白濃度按照BCA試劑盒說明書的操作步驟檢測(cè)蛋白濃度，可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線算出線性關(guān)系，再根據(jù)已知的樣本體積算出樣品的蛋白濃度。用含有PMSF的RIPA稀釋樣品，使各樣本濃度一致為5 g·L-1。

1.6.6.2 Western Blot法進(jìn)行SDS-PAGE凝膠配制后，將蛋白樣品和上樣緩沖液混勻，100 ℃或沸水加熱5 min，以充分變性蛋白，后裝入電泳槽內(nèi)，濕法轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜條件：恒流 400 mA，電壓75 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h。分別加入VEGF、C型凝集素家族14A(C-type lectin clomain containing 14A，CLEC14A)、CD81、GAPDH一抗(濃度比分別為11 000、11 000、12 000、15 000)。用TBST稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(濃度14 000)37 ℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h。化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀掃描結(jié)果后進(jìn)行灰度分析，應(yīng)用Image lab軟件分析此條帶的灰度值，并將其與之相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參條帶進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、HIF-1α及VEGF mRNA表達(dá)水平比較兩組患者子宮蛻膜組織中均有VEGF、CLEC14A、CD81、HIF-1α mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組比較，胚胎停育組子宮蛻膜組織中VEGF mRNA表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLEC14A、CD81、HIF-1α mRNA表達(dá)水平有改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各證型子宮蛻膜組織中 CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較與肝郁證比較，非肝郁證子宮蛻膜組織中VEGF mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD81、CLEC14A、HIF-1α mRNA表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各證型子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較

2.3 兩組患者子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，胚胎停育組子宮蛻膜組織中CLEC14A、VEGF蛋白表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD81、HIF-1α蛋白表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組患者子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各證型子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達(dá)水平比較與肝郁證比較，非肝郁證子宮蛻膜組織中CD81蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VEGF、CLEC14A、HIF-1α蛋白表達(dá)水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 各證型子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

胚胎停育患者子宮蛻膜組織中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，說明妊娠過程中胚胎的血管生成異?？赡苁桥咛ネＳ闹匾l(fā)病機(jī)制，與國(guó)內(nèi)外研究基本一致。良好的胎盤血管發(fā)育是胎盤與母體物質(zhì)交換功能的基礎(chǔ)，只有胎盤生成強(qiáng)大的血管網(wǎng)才能確保胚胎的營(yíng)養(yǎng)、血液、氧氣供給[8]。付昱等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎停育與妊娠早期的胎盤血管結(jié)構(gòu)異常、血管生成數(shù)量不足等密切相關(guān)。胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖功能受到VEGF表達(dá)水平的調(diào)控，血管生成的相關(guān)活性因子表達(dá)降低，絨毛的滋養(yǎng)細(xì)胞淺植入，導(dǎo)致胚胎蛻膜及絨毛的血管生成減少，胎盤血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建不完善，直接影響母胎間物質(zhì)交換及血液、氧氣供應(yīng)，最終導(dǎo)致胚胎停育[10]。國(guó)外學(xué)者[11]對(duì)母體螺旋動(dòng)脈重塑及滋養(yǎng)細(xì)胞侵入的過程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HIF-1α、VEGF在調(diào)節(jié)胚胎血管生成中發(fā)揮重要作用。黃凌佳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎中HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的異常表達(dá)與不良妊娠有關(guān)，胎盤血管的發(fā)育可能是通過激活HIF-1α信號(hào)通路及其靶基因VEGF來實(shí)現(xiàn)。值得注意的是，VEGF與早期妊娠的維系和胚胎血管的生成密切相關(guān)，在內(nèi)膜基質(zhì)的細(xì)胞產(chǎn)生蛻膜化中有重要意義[13]。Santi等[14]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其特異性受體在胚胎著床點(diǎn)附近的基質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。此外，在早期妊娠婦女的子宮蛻膜組織中同樣被檢測(cè)到VEGF及相關(guān)受體的高表達(dá)。Rabbani等[15]使用原位雜交技術(shù)檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其主要高表達(dá)位于胚胎著床位點(diǎn)附近的動(dòng)脈壁、母胎界面及細(xì)胞滋養(yǎng)層等腺上皮中，并在早期、中期、晚期妊娠中均能找到[16]，說明VEGF在早期妊娠過程中參與了重要角色[17]。早期妊娠失敗與VEGF低表達(dá)密切相關(guān)，其低表達(dá)可能是引起胚胎停育的主要因素[18]。

本研究結(jié)果顯示，各組均存在HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)，但是對(duì)照組較胚胎停育組明顯降低，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但蛋白條帶及表達(dá)量趨勢(shì)一致。HIF-1α信號(hào)通路是特異性的低氧反應(yīng)通路，根據(jù)機(jī)體氧含量來調(diào)節(jié)蛋白活性。HIF-1α在人體正常有氧條件下容易降解，其表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，但在低氧環(huán)境下降解快速減少，可迅速累積、聚合，使活性增強(qiáng)，并啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄[19]。研究表明[20]，HIF-1α可以通過誘導(dǎo)血管生成而發(fā)揮作用。正常妊娠也存在低氧狀態(tài)，低氧啟動(dòng)HIF-1α，上調(diào)VEGF表達(dá)，胚胎血管網(wǎng)絡(luò)逐漸形成減輕胚胎缺氧狀態(tài)，維系正常妊娠[21]。本研究結(jié)果提示，胚胎停育患者子宮蛻膜組織中HIF-1α表達(dá)較對(duì)照組更高，但VEGF表達(dá)卻下降，HIF-1α與VEGF呈負(fù)相關(guān)性，說明胚胎停育組患者VEGF的低表達(dá)可引起胚胎停育，是研究VEGF與胚胎停育關(guān)系的重要依據(jù)。由此可以預(yù)測(cè)，胚胎停育患者中存在更嚴(yán)重的低氧狀態(tài)，血管生成的動(dòng)態(tài)平衡被打破，HIF-1α表達(dá)異常升高，負(fù)反饋抑制了VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成的因子減少，抑制血管生成的因子增加，導(dǎo)致血管生成大量減少，胚胎缺乏足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供養(yǎng)，最終發(fā)生胚胎停育。楊躍濤[22]認(rèn)為，氣郁證患者靜脈血氧含量降低，二氧化碳含量升高，使機(jī)體處于二氧化碳潴留及缺氧狀態(tài)，體內(nèi)氧代謝狀況差，這與本研究肝郁證引起低氧啟動(dòng)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路表達(dá)導(dǎo)致胚胎缺血缺氧的理論存在相似性。

本研究中，胚胎停育組子宮蛻膜組織中CLEC14A蛋白及mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，但mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見高表達(dá)的CLEC14A可以促進(jìn)血管的生成，與VEGF的作用可能相似，可將其均歸為促進(jìn)血管生成的因子。CLEC14A和VEGF都表達(dá)于子宮蛻膜組織中，兩者都參與妊娠早期的血管新生，間接通過調(diào)控VEGF信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)血管的生成。

本研究結(jié)果顯示，僅有肝郁證子宮蛻膜組織中CD81蛋白表達(dá)均低于非肝郁證，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示CD81可能與VEGF的表達(dá)存在負(fù)性相關(guān)，而胚胎停育組與對(duì)照組子宮脫膜組織中CD81 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究基本一致。CD81的高表達(dá)表現(xiàn)為抑制血管新生或增加無效血管的生成，使滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力在一定程度上降低，引起新生血管腔直徑變小，血液供應(yīng)減少，從而發(fā)展為胚胎停育。因此，CD81也可作為評(píng)估胚胎停育發(fā)生的指標(biāo)。研究表明[23]，CD81表達(dá)升高，會(huì)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力來影響子宮螺旋動(dòng)脈重塑，使胎盤著床位置較淺。Shen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CD81在妊娠最早期開始出現(xiàn)，隨妊娠時(shí)間增長(zhǎng)，表達(dá)量遞減，而使同時(shí)期不良妊娠患者血液中仍有高表達(dá)量的CD81。CD81作為四次跨膜蛋白，表達(dá)有一定的不穩(wěn)定性，其磷酸化過程或半衰期不同時(shí)間段檢測(cè)會(huì)存在一定的差異。因此，對(duì)CD81的分組檢測(cè)存在一定的難度和不穩(wěn)定性。

本研究中，肝郁證胚胎停育的子宮蛻膜組織中VEGF mRNA的表達(dá)水平低于非肝郁證，說明肝郁在血管生成中扮演著重要角色。有學(xué)者[25]研究抑郁組和正常對(duì)照組的VEGF、HIF-1α表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑郁組及正常對(duì)照組存在差異，抑郁組患者血清中HIF-1α表達(dá)顯著增加。HIF-1α的增加正是由于機(jī)體缺氧所誘導(dǎo)，說明抑郁障礙患者血液中氧含量低于正常人[26]，存在不良情緒的患者可能長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)。目前，HIF-1α與肝郁證的研究尚處于初期階段，蔣莉婭等[27]采用清胰醒腦顆粒治療肝郁氣滯證小鼠，檢測(cè)模型組與肝郁證小鼠腦部組織HIF-1α mRNA，結(jié)果顯示，治療組HIF-1α mRNA表達(dá)較低。有學(xué)者[28]發(fā)現(xiàn)，抑郁狀態(tài)下的大鼠腦、心肌組織中HIF-1α蛋白顯著増高，抑郁狀態(tài)下的大鼠重要器官處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α蛋白活化、上調(diào)，從而引發(fā)其他臟器組織的損傷。HIF-1α是維持機(jī)體內(nèi)氧穩(wěn)定的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因素[29]，被認(rèn)為是機(jī)體在缺氧時(shí)編碼應(yīng)答基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，可促使VEGF基因表達(dá)的啟動(dòng)、激活[30]，并通過相關(guān)靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、能量的代謝、血管的生成、細(xì)胞的凋亡等，確保機(jī)體適應(yīng)或改變?nèi)毖鯛顟B(tài)[31]。

綜上所述，正常的生理功能都離不開氣血陰陽的調(diào)和暢達(dá)，血管生成也離不開氣血陰陽的調(diào)和。若婦女備孕時(shí)情志不暢或所求不遂日久，會(huì)出現(xiàn)不同程度的肝郁氣滯現(xiàn)象，情緒異常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α、VEGF表達(dá)下調(diào)，影響血管生成，使胚胎處于缺血、缺氧中，最終導(dǎo)致胚胎停育。低分子肝素或阿司匹林可用來治療胚胎停育，并非為了抗凝血，其目的是改善胚胎及子宮的血液供應(yīng)，促進(jìn)胚胎發(fā)育，與血管生成理論有許多共通之處，但是肝郁證導(dǎo)致的缺氧狀態(tài)應(yīng)該是胚胎停育更上游的因素。在今后研究中，可對(duì)HIF-1α、VEGF信號(hào)通路其他指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以期對(duì)胚胎停育、肝郁證、HIF-1α、VEGF之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究。